论文部分内容阅读
地锦草(Euphorbia humifusa)是一种常见中草药,生于原野、荒地、路旁、田间,分布于全国各地。众多学者对其化学成分、药理作用、临床应用做了研究,但对其黄酮类提取物的研究尚浅。本文以地锦草为研究对象,确立了地锦草总黄酮含量测定方法,建立了提取和分离纯化的工艺路线;并对地锦草黄酮抑菌作用、免疫药理作用进行了研究,分别从整体水平、细胞水平和分子水平上探讨其免疫作用机制。研究结果如下:1、运用正交试验优化超声破碎地锦草细胞的最佳条件,采用超声-加热回流-大孔树脂吸附的工艺流程提取分离纯化地锦草总黄酮,紫外分光光度法在波长510nm处测吸光度测地锦草总黄酮含量。试验结果表明:超声破碎的最佳条件为以料液比为1∶20,70%的乙醇为提取溶剂,60℃超声提取35min。影响超声提取效果大小的因素依次为提取时间＞溶剂浓度＞料液比＞提取温度。100g地锦草干燥全草提取纯化得到3.679g黄褐色粉末,经多种化学试剂鉴定,均成明显的黄酮反应。在3.679g地锦草黄酮粉末中,含纯黄酮3.131g,总得率为3.131%。2、采用纸片法测定地锦草总黄酮体外抗菌效果,并采用试管倍比稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:地锦草总黄酮对巴氏杆菌,沙门氏菌的体外抑菌作用较强,10mg/ml的总黄酮提取液对巴氏杆菌,沙门氏菌的抑菌直径分别达到22.0±1.0(mm),26.0±2.0(mm),随着黄酮浓度的增加,其抑菌作用也增强。本实验测得地锦草黄酮对巴氏杆菌,沙门氏菌的MIC分别为1.25mg/ml,0.625mg/ml,沙门氏菌的MBC浓度为1.25mg/ml。地锦草总黄酮提取液对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和链球菌也有一定的抑制作用。3、采用常规免疫药理学试验技术将地锦草总黄酮的3个剂量组与对照组进行比较,结果显示:脾指数、碳廓清指数(K)、吞噬指数(a)、足趾增厚值均显著高于空白组,说明一定剂量的地锦草黄酮具有提高免疫作用的能力。4、采用RT-PCR测定小鼠脾组织中IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-αmRNA的表达水平,试验结果表明:①H组和M组IL-2 mRNA表达水平均升高,与C组相比,H组和M组极显著差异(P＜0.01);②与对照组相比,三个剂量的地锦草黄酮对IL-12 mRNA表达水平稍有提高,但差异不是很显著(P＞0.05);③TNF-γmRNA表达水平均有提高,特别是H剂量组(P＜0.01);④与对照组相比,各个剂量的地锦草黄酮对TNF-αmRNA表达水平均有升高,且差异显著(P＜0.01)。说明地锦草黄酮三个剂量组均能提高IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-αmRNA的表达水平,从而提高机体的免疫功能与抗病能力。综上所述,超声-加热回流-大孔树脂吸附提取分离纯化地锦草总黄酮的方法操作简单,重复性好,提取的总黄酮含量高,纯度好。研究表明,地锦草黄酮具有体外抑菌活性;在在一定剂量范围内能有效提高小鼠的免疫功能及IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA表达。