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研究背景:
我国冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病率呈逐年升高的态势发展,最新统计结果显示,截止2018年底,全国患有CHD的总人数约1100万人,随着溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)及冠脉搭桥手术等救治手段的普及和应用,大部分CHD患者暂时性的脱离了生命危险,但伴随而来的是心肌缺血/再灌注(ischemia/ reperfusion, I/R)损伤的发生.I/R损伤可导致心肌细胞发生离子代谢紊乱和心肌细胞凋亡等一系列心肌病理性改变,进而引发心率失常和心功能不全等心脏疾病.为此,积极探究心肌I/R损伤的发病机制并明确有效的救治方案具有重要研究意义.
近年来研究发现,线粒体是一种不断的进行着融合与分裂动态变化的细胞器,该过程被称为线粒体动力学.在心肌细胞内线粒体呈线性排列,与肌纤维紧密相邻,在生理条件下,线粒体始终保持着一种融合与分裂的动态变化状态,当线粒体大部分处于融合状态时,线粒体功能正常,能够为心肌细胞的生存提供充足的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP).生理状态下线粒体亦存在着适度的分裂,可清除受损的线粒体,维持线粒体群体的健康,但当线粒体过度分裂时,线粒体会失去膜电位,释放大量的细胞色素C及线粒体凋亡蛋白等,诱发线粒体凋亡途径,引起心肌损伤.线粒体动力学与心肌I/R损伤有着密切的联系,有研究证实当心肌发生I/R损伤后,线粒体异常分裂加重,呈碎片状散布在肌纤维之间.调控线粒体融合与分裂的主要物质是线粒体的融合蛋白和分裂蛋白,在一定条件下,抑制分裂蛋白表达或过表达融合蛋白,均可实现抑制心肌I/R损伤时线粒体的异常分裂的作用,进而达到保护受损心肌的目的.
本课题组多年来始终致力于研究κ-阿片受体(κ-opioidreceptor,κ-OR)在心血管系统中的调节作用,取得了一定的研究成果.前期研究发现,在缺血前活化κ-OR可减轻I/R后的心肌损伤,作用机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, PKB or Akt)调控内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synsase, eNOS)有关.Akt在各类蛋白激酶中功能较为特殊,主要负责调控细胞的存活与凋亡,而线粒体动力学同样参与调节心肌细胞的存活与凋亡,但活化κ-OR是否对再灌注后线粒体动力学具有调节作用,如果有调节作用,又是否与PI3K-Akt通路相关尚不清楚.基于线粒体分裂增加在心肌缺血损伤中的重要作用,本研究旨在探索再灌注前活化κ-OR对缺血/再灌注心肌线粒体分裂的作用及其机制.
研究目的:
(1)明确活化κ-OR减轻心肌I/R损伤的效应;
(2)探讨活化κ-OR能否抑制I/R心肌的线粒体分裂;
(3)如果能,探讨活化κ-OR抑制心肌线粒体分裂的机制.
研究方法:
(1)将成年SD大鼠随机分成6组,分别为假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R)、缺血/再灌注+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+U)、缺血/再灌注+κ-OR阻断剂nor-BNI+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+N+U)、缺血/再灌注+PI3K阻断剂wortmannin+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+W+U)、缺血/再灌注+Akt阻断剂MK2206+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+M+U).通过结扎/松扎大鼠冠脉的方式制作大鼠I/R损伤模型,模型建立成功后,对各组大鼠的心肌组织及血清分别进行以下实验研究:①比色法检测各组大鼠血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)值的变化情况;②2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride, TTC)-伊文氏蓝双染检测各组大鼠心梗面积变化;③TUNEL染色检测各组大鼠心肌细胞凋亡变化;④透射电镜观察各组大鼠心肌线粒体形态学变化;⑤Westernbloting检测线粒体融合与分裂蛋白以及PI3K、Akt的表达变化;
(2)将H9C2细胞系随机分成6组,分别为对照组(Control )、缺氧/复氧组(hypoxia/reoxygenation, H/R)、缺氧/复氧+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+U)、缺氧/复氧+κ-OR阻断剂nor-BNI+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+N+U)、缺氧/复氧+PI3K阻断剂wortmannin+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+W+U)、缺氧/复氧+Akt阻断剂MK2206+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+M+U).对各组细胞进行以下实验研究:①细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)检测各组细胞活力变化;②流式细胞仪检测各组细胞凋亡变化;③激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体形态学变化;④Westernbloting检测相关蛋白表达情况.
研究结果:
一、κ-OR活化对心肌I/R损伤的作用
(1)与Sham组相比,I/R组大鼠血清CK值明显增高,出现明显的心肌梗死(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组血清CK值明显降低,心梗面积明显减小(P<0.01);上述U50,488H减轻I/R心肌损伤的作用可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(2)与Sham组相比,I/R组心肌凋亡指数明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组心肌凋亡指数明显减少(P<0.01);上述U50,488H减轻I/R心肌凋亡指数的作用可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(3)与Control组相比,H/R组H9C2细胞活力明显降低,细胞凋亡明显增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组H9C2细胞活力增高,细胞凋亡降低(P<0.01);上述U50,488H减轻细胞H/R损伤的效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01).
二、κ-OR活化对I/R心肌线粒体分裂的影响
(1)与Sham组相比,I/R组线粒体横截面积减小,数目增多,提示线粒体分裂明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组线粒体横截面积增大,数目减少(P<0.05),线粒体分裂现象减轻;上述U50,488H对I/R心肌线粒体分裂的抑制效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.05);
(2)Control组H9C2细胞线粒体呈现为条索状;与Control组相比,H/R组线粒体呈现为点状,线粒体平均横截面积减小,数目增多,线粒体分裂明显增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组线粒体平均横截面积增大,数目减少,线粒体分裂明显减轻(P<0.01);上述U50,488H对H/R细胞线粒体分裂的抑制效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01).
三、κ-OR活化对融合/分裂蛋白的影响及相关作用机制
(1)与Sham组相比,I/R组磷酸化PI3K和磷酸化Akt(Ser473)的表达增加(P<0.05);与I/R组相比,I/R+U组磷酸化PI3K和磷酸化Akt(Ser473)的表达进一步增加(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化PI3K的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI与PI3K抑制剂wortmannin所阻断,但不能够被Akt抑制剂MK2206所阻断,而U50,488H对磷酸化Akt的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(2)线粒体融合相关蛋白(Mfn1,Mfn2,Opa1)与分裂相关蛋白(Drp1,Fis1)的总表达量在各组间无明显差异.与Sham组相比,I/R组磷酸化Drp1(Ser637)表达量显著降低,磷酸化Drp1(Ser616)表达量明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组磷酸化Drp1(Ser637)表达量显著增加(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)表达量明显降低(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化Drp1的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断;
(3)H9C2细胞蛋白检测结果显示,与Control组相比,H/R组磷酸化Drp1(Ser637)的表达量降低(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)的表达量增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组磷酸化Drp1(Ser637)的表达量增加(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)的表达量降低(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化Drp1的调节效应亦可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断.
结论:
(1)活化κ-OR对I/R心肌具有保护作用;
(2)活化κ-OR可抑制I/R心肌线粒体异常分裂;
(3)活化κ-OR通过PI3K-Akt通路促进分裂蛋白Drp1(Ser637)发生磷酸化反应、抑制Drp1(Ser616)发生磷酸化,从而抑制线粒体过度分裂.
我国冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病率呈逐年升高的态势发展,最新统计结果显示,截止2018年底,全国患有CHD的总人数约1100万人,随着溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)及冠脉搭桥手术等救治手段的普及和应用,大部分CHD患者暂时性的脱离了生命危险,但伴随而来的是心肌缺血/再灌注(ischemia/ reperfusion, I/R)损伤的发生.I/R损伤可导致心肌细胞发生离子代谢紊乱和心肌细胞凋亡等一系列心肌病理性改变,进而引发心率失常和心功能不全等心脏疾病.为此,积极探究心肌I/R损伤的发病机制并明确有效的救治方案具有重要研究意义.
近年来研究发现,线粒体是一种不断的进行着融合与分裂动态变化的细胞器,该过程被称为线粒体动力学.在心肌细胞内线粒体呈线性排列,与肌纤维紧密相邻,在生理条件下,线粒体始终保持着一种融合与分裂的动态变化状态,当线粒体大部分处于融合状态时,线粒体功能正常,能够为心肌细胞的生存提供充足的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP).生理状态下线粒体亦存在着适度的分裂,可清除受损的线粒体,维持线粒体群体的健康,但当线粒体过度分裂时,线粒体会失去膜电位,释放大量的细胞色素C及线粒体凋亡蛋白等,诱发线粒体凋亡途径,引起心肌损伤.线粒体动力学与心肌I/R损伤有着密切的联系,有研究证实当心肌发生I/R损伤后,线粒体异常分裂加重,呈碎片状散布在肌纤维之间.调控线粒体融合与分裂的主要物质是线粒体的融合蛋白和分裂蛋白,在一定条件下,抑制分裂蛋白表达或过表达融合蛋白,均可实现抑制心肌I/R损伤时线粒体的异常分裂的作用,进而达到保护受损心肌的目的.
本课题组多年来始终致力于研究κ-阿片受体(κ-opioidreceptor,κ-OR)在心血管系统中的调节作用,取得了一定的研究成果.前期研究发现,在缺血前活化κ-OR可减轻I/R后的心肌损伤,作用机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, PKB or Akt)调控内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synsase, eNOS)有关.Akt在各类蛋白激酶中功能较为特殊,主要负责调控细胞的存活与凋亡,而线粒体动力学同样参与调节心肌细胞的存活与凋亡,但活化κ-OR是否对再灌注后线粒体动力学具有调节作用,如果有调节作用,又是否与PI3K-Akt通路相关尚不清楚.基于线粒体分裂增加在心肌缺血损伤中的重要作用,本研究旨在探索再灌注前活化κ-OR对缺血/再灌注心肌线粒体分裂的作用及其机制.
研究目的:
(1)明确活化κ-OR减轻心肌I/R损伤的效应;
(2)探讨活化κ-OR能否抑制I/R心肌的线粒体分裂;
(3)如果能,探讨活化κ-OR抑制心肌线粒体分裂的机制.
研究方法:
(1)将成年SD大鼠随机分成6组,分别为假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R)、缺血/再灌注+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+U)、缺血/再灌注+κ-OR阻断剂nor-BNI+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+N+U)、缺血/再灌注+PI3K阻断剂wortmannin+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+W+U)、缺血/再灌注+Akt阻断剂MK2206+κ-OR激动剂U50,488H组(I/R+M+U).通过结扎/松扎大鼠冠脉的方式制作大鼠I/R损伤模型,模型建立成功后,对各组大鼠的心肌组织及血清分别进行以下实验研究:①比色法检测各组大鼠血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)值的变化情况;②2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride, TTC)-伊文氏蓝双染检测各组大鼠心梗面积变化;③TUNEL染色检测各组大鼠心肌细胞凋亡变化;④透射电镜观察各组大鼠心肌线粒体形态学变化;⑤Westernbloting检测线粒体融合与分裂蛋白以及PI3K、Akt的表达变化;
(2)将H9C2细胞系随机分成6组,分别为对照组(Control )、缺氧/复氧组(hypoxia/reoxygenation, H/R)、缺氧/复氧+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+U)、缺氧/复氧+κ-OR阻断剂nor-BNI+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+N+U)、缺氧/复氧+PI3K阻断剂wortmannin+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+W+U)、缺氧/复氧+Akt阻断剂MK2206+κ-OR激动剂U50,488H组(H/R+M+U).对各组细胞进行以下实验研究:①细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)检测各组细胞活力变化;②流式细胞仪检测各组细胞凋亡变化;③激光共聚焦显微镜检测各组细胞线粒体形态学变化;④Westernbloting检测相关蛋白表达情况.
研究结果:
一、κ-OR活化对心肌I/R损伤的作用
(1)与Sham组相比,I/R组大鼠血清CK值明显增高,出现明显的心肌梗死(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组血清CK值明显降低,心梗面积明显减小(P<0.01);上述U50,488H减轻I/R心肌损伤的作用可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(2)与Sham组相比,I/R组心肌凋亡指数明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组心肌凋亡指数明显减少(P<0.01);上述U50,488H减轻I/R心肌凋亡指数的作用可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(3)与Control组相比,H/R组H9C2细胞活力明显降低,细胞凋亡明显增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组H9C2细胞活力增高,细胞凋亡降低(P<0.01);上述U50,488H减轻细胞H/R损伤的效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01).
二、κ-OR活化对I/R心肌线粒体分裂的影响
(1)与Sham组相比,I/R组线粒体横截面积减小,数目增多,提示线粒体分裂明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组线粒体横截面积增大,数目减少(P<0.05),线粒体分裂现象减轻;上述U50,488H对I/R心肌线粒体分裂的抑制效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.05);
(2)Control组H9C2细胞线粒体呈现为条索状;与Control组相比,H/R组线粒体呈现为点状,线粒体平均横截面积减小,数目增多,线粒体分裂明显增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组线粒体平均横截面积增大,数目减少,线粒体分裂明显减轻(P<0.01);上述U50,488H对H/R细胞线粒体分裂的抑制效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01).
三、κ-OR活化对融合/分裂蛋白的影响及相关作用机制
(1)与Sham组相比,I/R组磷酸化PI3K和磷酸化Akt(Ser473)的表达增加(P<0.05);与I/R组相比,I/R+U组磷酸化PI3K和磷酸化Akt(Ser473)的表达进一步增加(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化PI3K的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI与PI3K抑制剂wortmannin所阻断,但不能够被Akt抑制剂MK2206所阻断,而U50,488H对磷酸化Akt的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断(P<0.01);
(2)线粒体融合相关蛋白(Mfn1,Mfn2,Opa1)与分裂相关蛋白(Drp1,Fis1)的总表达量在各组间无明显差异.与Sham组相比,I/R组磷酸化Drp1(Ser637)表达量显著降低,磷酸化Drp1(Ser616)表达量明显增加(P<0.01);与I/R组相比,I/R+U组磷酸化Drp1(Ser637)表达量显著增加(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)表达量明显降低(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化Drp1的调节效应可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断;
(3)H9C2细胞蛋白检测结果显示,与Control组相比,H/R组磷酸化Drp1(Ser637)的表达量降低(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)的表达量增加(P<0.01);与H/R组相比,H/R+U组磷酸化Drp1(Ser637)的表达量增加(P<0.01),磷酸化Drp1(Ser616)的表达量降低(P<0.01);上述U50,488H对磷酸化Drp1的调节效应亦可被κ-OR阻断剂nor-BNI、PI3K抑制剂wortmannin和Akt抑制剂MK2206所阻断.
结论:
(1)活化κ-OR对I/R心肌具有保护作用;
(2)活化κ-OR可抑制I/R心肌线粒体异常分裂;
(3)活化κ-OR通过PI3K-Akt通路促进分裂蛋白Drp1(Ser637)发生磷酸化反应、抑制Drp1(Ser616)发生磷酸化,从而抑制线粒体过度分裂.