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进行链霉菌(Streptomyces)重要代谢产物生物合成调控与形态分化关系的研究,对于揭示生命现象的特征有重要的意义。同时进行次级代谢产物生物合成中相关基因的研究是揭示其合成途径的基础,具有潜在应用前景。
本论文主要获得了如下结果:
1.ino1是链霉菌发育分化必需的基因。前期转录组研究显示,发育分化调控基因whiI能够影响基因组上毗邻的SC03900(inoR,编码PadR类负调控基因)和SCO3899(ino1,编码肌醇-1-磷酸合成酶,为肌醇合成的限速酶)在内的45个基因的表达,对ino1的研究表明,ino1是发育分化必需的基因,其催化合成的产物肌醇很可能是天蓝色链霉菌形态分化过程中的重要因子。
诱导高表达inoR导致天蓝色链霉菌产生光秃表型,并且与ino1破坏株一样,外源添加肌醇能够使其恢复野生型表型,表明:inoR通过影响肌醇的生物合成负调控链霉菌的发育分化;EMSA分析显示InoR能够特异性的结合自身启动子但不能够同ino1启动子结合,同时反转录分析表明inoR能够同其下游基因ino1共转录形成多顺反子,这些结果暗示了inoR存在自调控,并很可能通过转录通读调控ino1的表达;inoR的破坏导致链霉菌发育分化提前,体内转录分析证实,inoR自抑制并通过转录通读显著上调了ino1的表达;对四种利用不同策略构建的inoR突变株进行Western blot检测表明:Ino1的表达水平同链霉菌分化进程紧密相关,暗示了链霉菌体内存在有精细的ino1表达调控机制;whiI突变株内对ino1以及inoR的时序转录分析表明,Pinol以及PinoR均受到whiI的正调控,在孢子成熟时期(72hr)显著的上调,随后两者均恢复至之前的组成型表达水平;综合上述结果表明,ino1催化的肌醇生物合成严格控制了链霉菌的发育分化,而whiI和inoR共同组成了一个对ino1表达进行精细调控的环路。同时本研究为解决inoR破坏而导致的极性效应影响,利用PCR targeting技术首创了一种用于构建基因染色体原位缺失突变的方法。
2.sanF可能参与了尼可霉素核苷部分的生物合成。对圈卷产色链霉菌(S.ansochromogenes)核苷肽类抗真菌抗生素尼可霉素生物合成相关基因sanF的研究显示,其破坏导致尼可霉素组分X、Z合成的缺失及抗真菌活性的丧失,而单拷贝的sanF能够恢复其尼可霉素X、Z的生物合成,表明sanF是尼可霉素生物合成的必需基因。对sanF功能的进一步研究以及sanF与多氧霉素生物合成基因簇中同源基因polD的比较分析,暗示了sanF很可能参与了尼可霉素核苷单元的生物合成。
3.抗真菌活性物质的筛选。对来自特殊生境的三株链霉菌进行了抗真菌抗生素的分离纯化。首先建立了以绿色木霉(Trichoderma viride)为指示菌的抗真菌物质的活性检测系统,随后通过溶剂萃取、硅胶柱层析以及制备性HPLC等方法我们获得了一个抗真菌活性物质,经过质谱分析以及核磁共振研究,最后确定这个活性物质为已经在D30同种的灰色链霉菌内发现的抗真菌抗生素放线菌酮。