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目的:通过益气健脾活血法对线粒体凋亡的调控作用研究,探寻益气健脾活血法防治T2DM骨骼肌细胞病变的作用靶点及作用规律,揭示其治疗机制,为益气健脾活血法的临床应用提供科学依据,也为中医药防治T2DM骨骼肌病变提供新的研究思路。方法:将SPF级SD大鼠,随机分为2组,每组20只,即空白组和中药组,中药组给予参芪复方3mL(2mg生药/mL)中药浸膏灌胃。正常组给予等体积生理盐水灌胃,每日2次,连续3天。于末次灌胃1h后腹主动脉取血,室温静置2h,4℃离心,取血清,56℃水浴30min灭活,-80℃冻存备用。取第4代大鼠L6肌细胞胰酶消化后,加DMEM(含10%FBS)培养液于离心管中,吹打,混匀。细胞密度接近70%时,更换无血清培养基继续培养24h,使细胞同步化。每6孔细胞为一组,分组与刺激方法如下:取第4代大鼠L6肌细胞接种于T75培养瓶,细胞密度接近70%时,更换无血清培养基继续培养24h,使细胞同步化。分组干预方法如下:(1)HBM高糖模型组;(2)HRM高糖对照组;(3)HLS5%中药含药血清组;(4)HMS10%中药含药血清组;(5)HHS15%中药含药血清组;(6)HBL罗格列酮组;(7)CTRL空白对照组。上述干预液配制完成后,0.22μm过滤。将加各种刺激的细胞置37℃、5%CO2孵箱培养,在培养24、48、72h时收集细胞,进行指标检测。分别测试测试线粒体肿胀度,线粒体膜电位的改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot方法检测:腓肠肌细胞质中Caspase-3、Caspase-9的表达。结果:1.细胞凋亡率检测可见,中药含药血清组(HMS)凋亡率最低,罗格列酮组(HBL)细胞凋亡率次之,高糖对照组(HRM)及高糖模型组(HBM)凋亡率较高。2.L6细胞线粒体膜电位△Ψm可见空白对照组(CTRL)膜电位最高,中药含药血清组(HMS)膜电位次之,罗格列酮组(HBL)第三,高糖模型组(HBM)及高糖对照组(HRM)膜电位最低。3.细胞线粒体肿胀度可见空白对照组(CTRL)中,罗格列酮含药血清组(HBL)线粒体肿胀度最低,高糖对照组(HRM)及高糖模型组(HBM),中药含药血清组(HMS)细胞肿胀度较高。4.RT-qPCR检测可见高糖对照组(HRM)引起Caspase-3 mRNA,Caspase-9 mRNA表达水平显著升高。5.Western blotting检测结果显示高糖对照组(HRM)及高糖模型组(HBM)的Caspase-3,Caspase-9的蛋白表达水平明显升高。6.ELISA检测可见培养液中胰岛素含量基本相同,结果呈阴性。结论:1.高糖环境下中药含药血清组及罗格列酮含药血清组对线粒体细胞凋亡有一定的抑制作用。2.线粒体膜电位(MMP)测量可见,中药含药血清组及罗格列酮含药血清组膜电位高于高糖对照组及高糖模型组膜电位,说明中药含药血清组及罗格列酮含药血清组对细胞凋亡的开始有一定的抑制延迟作用。3.线粒体肿胀度测量可见,各测试组线粒体均发生肿胀,罗格列酮含药血清组肿胀度较小,说明罗格列酮含药血清对控制线粒体肿胀效果较为突出。4.Western blotting检测:高糖对照组及高糖模型组的Caspase-3及Caspase-9的蛋白水平较其他组明显上升,活性增强,形成凋亡小体,导致线粒体细胞凋亡发生,以至出现T2DM骨骼肌病变。5.RT-qPCR检测:高糖对照组及高糖模型组引起Caspase-3 mRNA及Caspase-9 mRNA明显升高,与其他物质形成凋亡小体,导致细胞线粒体凋亡发生,以至出现T2DM骨骼肌病变6.L6骨骼肌细胞培养液胰岛素含量,可见每组胰岛素含量接近,即为所有组对胰岛素含量影响差距不大,无统计学意义综上,基于益气健脾活血法所成方参芪复方能够通过调控线粒体凋亡防治T2DM骨骼肌病变。