背景和目的临床上常见到骨缺损难以愈合的情况,如牙根周围大面积骨缺失导致牙齿的松动脱落,肿瘤或者外伤引起的颌骨缺损及病理性骨吸收导致牙槽嵴骨量的不足等情况,如何修复大面积的骨缺损仍是目前临床工作中亟待解决的难题之一[1]。目前骨缺损修复技术主要是利用组织或生物材料对缺损区进行重建,包括自体骨移植、异体骨移植和骨替代材料移植等方法。利用肋骨、髂骨等自体骨进行骨移植很难达到理想的骨形态修复,并且会带来自身组织损伤,可能出现供区感染等并发症。异体骨移植和骨替代材料移植的主要问题在于免疫排斥反应,其成血管化和成骨速度较慢。骨组织工程主要优势在于应用自身来源的自体细胞所带来的低感染性和低致癌性,免疫排斥反应小。然而,由于口腔内特殊的微环境和复杂多变的病因,目前还没有令人十分满意的骨再生方法。近年来,基因治疗技术与组织工程的迅猛发展为口腔颌面骨再生治疗提供了新思路[2,3]。种子细胞、生长因子、支架载体是传统组织工程学研究领域的主要内容,随着基因治疗技术的发展,克服了局部应用外源性生长因子的众多缺点,如实施过程复杂、成本高、半衰期短且易在体内被酶解、毒副作用、扩散较快难以维持有效治疗浓度等,通过外源性基因编辑的干细胞长期稳定的表达目的蛋白成为当前研究热点[4,5]。本课题组以原代培养的大鼠牙龈间充质干细胞(gingival-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)作为体外实验的种子细胞模型,研究信号素3A(Semaphorin 3A,Sema3A)转染对GMSCs成骨向分化的促进作用及对破骨前体细胞活化的抑制作用,初步探讨其作用机制;并以Wistar大鼠颅骨骨缺损模型作为体内实验的动物模型,检测Sema3A修饰的GMSCs对大鼠骨缺损修复效能的影响,以期为临床治疗中口腔颌面骨组织再生提供科学依据。目前在口腔骨再生医学中应用广泛的干细胞主要有牙源性干细胞和非牙源性干细胞两大类。牙源性干细胞主要有牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)[6,7]、牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)[8]、GMSCs[9];非牙源性干细胞主要有骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)[10]和脂肪干细胞(adipose stem cells,ADSCs)[11]。牙龈是口腔中的一种特殊组织,覆盖在牙槽嵴和磨牙后区,是口腔黏膜免疫和生物化学屏障的特殊组成部分。在生理状态下健康的牙龈组织表现出伤口愈合速度快和无瘢痕愈合的特点[12]。近年来研究发现来源于牙龈组织的间充质细胞具有临床应用潜能,与其他间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相比,GMSCs具有取材方便且对机体的损伤小、易大量扩增、核型稳定等优点,使得GMSCs成为具有潜在实用价值的种子细胞[9],但亦有相反的研究报道指出,与PDLSCs相比,GMSCs体外矿化能力较弱,不利于骨组织再生,对于这一研究结果目前尚存争议[13,14]。信号素3A(Sema3A)是第一个在脊椎动物中被发现的信号素,其调控作用最为典型,在神经系统[15]、心血管系统[16]、肿瘤的发生及免疫调节[17]等生理或病理过程中发挥重要的作用。研究发现临床中患者颅脑外伤合并骨折的情况比单纯骨折时骨痂形成速度快,甚至对于不规则的颌骨骨折合并颅脑外伤时,骨愈合速度增快[18,19]。后期实验证明颅脑外伤时机体通过分泌多种细胞因子调节骨修复,其中Sema3A是目前研究较多的调节因子[20]。通过对Sema3A更深入的研究发现其在骨代谢方面也发挥重要调节作用[21-23]。我们通过文献研究发现,Sema3A基因敲除的实验小鼠出现骨发育不良的表现。局部注射Sema3A重组蛋白促进成骨的同时未见治疗区异常骨吸收,这些都表明Sema3A可能具有双向调节骨代谢的作用,促进成骨的同时抑制破骨[21,24]。目前广泛应用在组织工程中促成骨的生长因子包括骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等,体外实验证实有效增强成骨相关基因的表达,诱导间充质细胞成骨向分化。然而,破骨细胞和成骨细胞之间相互偶联作用,BMP在促进骨形成的同时活化了破骨细胞进一步参与骨改建[25-27]。BMP多以蛋白形式结合支架材料或者结合缓释载体的方式作用于缺损区促进骨再生。应用蛋白作为促成骨因子就会面临蛋白降解、作用有效期、成本较高及产品稳定性等问题,而成骨的过程是一个长时间的作用过程,我们更需要促成骨因子的持续性供给。因此,我们假设:采用基因治疗的方法,通过病毒转染的方式把Sema3A基因整合到靶细胞中持续发挥促成骨分化作用的同时抑制破骨细胞活化,并通过体外和体内实验证实这一假设。基于以上认识,本课题首先体外分离纯化培养大鼠GMSCs(rGMSCs),构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并成功转染rGMSCs,建立Sema3A修饰的rGMSCs体系,然后在体外矿化诱导条件下,研究Sema3A转染对rGMSCs成骨分化的影响并探讨其相关机制;其次,体外建立细胞间接共培养体系,检测Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响及探讨相关机制;同时构建Wistar大鼠颅骨骨缺损动物模型,进一步通过体内动物实验研究Sema3A修饰rGMSCs对骨缺损修复效能的影响,为其在口腔骨组织工程中的应用提供理论基础。实验方法1.Sema3A转染对rGMSCs成骨分化作用的影响1.1 rGMSCs分离培养及鉴定从山东大学动物中心购进的4周龄SPF级Wistar雄性大鼠数只,采用酶消化法从下颌磨牙颊舌侧牙龈组织中获得原代牙龈细胞,消化传代后利用有限稀释克隆法获得具有干细胞特性的牙龈间充质细胞进行传代培养。对纯化的rGMSCs分别进行克隆形成率(colony forming unit,CFU)分析、流式细胞术检测细胞表面分子表达,成脂诱导培养和成骨诱导培养并通过油红O染色和茜素红染色鉴定rGMSCs的多向分化潜能。1.2构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCs设计Sema3A基因特异性引物并扩增,酶切目的基因和载体(pLenO-GTP)进行连接反应,转化连接产物到大肠杆菌DH5A中,质粒小提后重组酶切鉴定,质粒大提。病毒包装系统合并转染试剂加入293T细胞中,收集转染后的病毒上清液,超浓缩后-80℃保存备用。将rGMSCs以细胞密度为1×104个/cm2接种于96孔板中,细胞共分为3组:空白对照组、空载体组(Lv-NC组)、Sema3A转染 rGMSCs 组(Lv-Sema3A 组),每组均设定 5 个感染复数(multiplicity of infection,MOI)值(MOI=30,50,80,100,120),筛选慢病毒载体转染rGMSCs最佳的MOI值;用最佳MOI值计算病毒量并转染rGMSCs,通过荧光显微镜观察、流式细胞仪检测转染效率,Real-time PCR和Western blot方法分析Sema3A转染rGMSCs的可行性。1.3 Sema3A转染促进rGMSCs成骨分化的作用研究矿化诱导条件下,检测Sema3A转染对rGMSCs成骨分化相关因子ALP、Runx2、OCN的mRNA及蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,在倒置相差显微镜下观察细胞矿化结节形成情况,茜素红染色并应用十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后用酶标仪检测吸光度值对细胞外基质中矿化结节的钙含量进行半定量分析。上述实验均重复至少三次,分析体外矿化诱导培养条件下Sema3A转染对rGMSCs体外成骨分化的影响。2.体外共培养体系下,Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响选择鼠源性的单核-巨噬细胞系(RAW264.7细胞)作为破骨前体细胞,体外构建间接共培养系统,将rGMSCs、Sema3A转染rGMSCs、空载体转染rGMSCs分别与RAW264.7共培养,siRNA降低Sema3A转染rGMSCs的Nrp1受体表达后与 RAW264.7 共培养,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测破骨细胞特异性分化情况;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同时间点各组共培养液中Sema3A的含量;Real-time PCR 和 Western blot 检测共培养 RAW264.7 细胞中 RANKL、OPG 的mRNA和蛋白的表达水平。上述实验均重复至少三次。3.Sema3A修饰rGMSCs促进大鼠骨缺损修复的实验研究选择雄性8周龄SPF级Wistar大鼠55只,随机分组将大鼠分为5组,每组10只,余5只备用,实验分组:Sema3A转染rGMSCs和胶原载体复合物组;空载体转染rGMSCs和胶原载体复合物组;rGMSCs和胶原载体复合物组;胶原载体组;单纯骨缺损空白组。制备大鼠颅骨骨缺损动物模型,分别将各组细胞种植于胶原膜中,培养细胞-胶原膜复合物并移植入骨缺损处,胶原载体组放置等体积的胶原膜,严密缝合,空白组直接缝合。于常规喂养8周后采用心脏内灌注法获得颅骨标本,通过标本大体观察、X线检查、HE染色、Masson染色等方法观察各组骨缺损修复的效果。实验结果1.Sema3A转染对rGMSCs成骨分化作用的影响1.1 rGMSCs分离培养和鉴定rGMSCs原代培养3天后,倒置显微镜下观察细胞贴壁生长,分散且形态不规则,约4-5天左右长满皿底80%-90%,可传代培养。传代后细胞呈集落样增殖,形态单一为长梭形、多角形和不规则形态,CFU结果显示rGMSCs克隆形成率约为58%。用有限稀释法获得单克隆形成单位,扩大培养后得到具有自我更新能力的rGMSCs。流式细胞仪检测显示,CD44、CD90、CD29阳性表达,CD45、CD11b阴性表达。rGMSCs矿化诱导培养4周后茜素红染色可见实验组细胞外基质有红染矿化结节,常规培养的对照组未见明显改变。成脂诱导培养3周后油红O染色可见实验组细胞胞质内出现红染脂滴,常规培养的对照组未见明显改变。1.2构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCsPCR扩增目的基因Sema3A CDS区域,PCR产物纯化后用BamHI/XbaI双酶切与相同酶切位点的载体(pLenO-GTP)连接反应,连接产物转化DH5A感受态,阳性克隆鉴定后质粒纯化抽提。将构建的携带Sema3A基因的载体、病毒包装系统共转染293T细胞,培养48小时后收集细胞上清液纯化、浓缩,获得病毒原液滴度为实验组:2.7× 109 TU/ml;空载体组:1.8×109 TU/ml。筛选病毒转染GMSCs最佳MOI值,用MOI=80转染rGMSCs经嘌呤霉素筛选后,流式细胞术检测转染效率达99%以上。Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白对照组相比,LCv-Sema3A组Sema3A mRNA和蛋白的表达量显著升高。1.3 Sema3A转染对rGMSCs成骨分化的作用成骨诱导培养第3天、7天、14天,与空白对照组相比,Lv-Sema3A组成骨相关基因ALP、Runx2、OCN mRNA和蛋白的表达增高。成骨诱导培养28天,与对照组相比,茜素红染色显示Lv-Sema3A组矿化结节形成显著增多。十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后用酶标仪检测吸光度值,半定量结果显示,与对照组相比,Lv-Sema3A组细胞外基质钙离子沉积量显著增多。2.体外共培养体系下,Sema3A转染rGMSCs对破骨前体细胞分化的影响建立细胞共培养体系后,加入含有30ng/ml可溶性RANKL的诱导培养液诱导培养5天后,应用TRAP染色检测空白对照组(RAW264.7组)、共培养组:RAW264.7-Control 组、RAW264.7-Lv-NC 组、RAW264.7-Lv-Sema3A 组 RAW264.7细胞分化情况。与空白对照组相比,共培养各组TRAP+的破骨细胞样细胞数均有减少;与RAW264.7-Control组相比,Sema3A转染rGMSCs显著抑制了 RANKL诱导下RAW264.7细胞TRAP+的破骨细胞样细胞形成;采用siRNA降低Nrp1受体的表达后,Sema3A转染rGMSCs对RANKL诱导下RAW264.7细胞破骨向分化的抑制作用显著减弱。ELISA检测诱导培养3天、5天、7天后共培养液中Sema3A 的浓度,与 RAW264.7-Control 组相比,RAW264.7-Lv-Sema3A 组培养液中Sema3A浓度显著增加且随着培养时间的延长而逐渐增加。Real-time PCR和Western blot结果显示,共培养组和单独培养RAW264.7组相比,RANKL mRNA和蛋白表达水平均降低,而OPG mRNA和蛋白表达水平均升高,OPG/RANKL的比值升高。与 RAW264.7-Control 组相比,RAW264.7-Lv-Sema3A 组 RANKL mRNA和蛋白表达水平显著降低,而OPG mRNA和蛋白表达水平显著升高,OPG/RANKL的比值显著升高。3.Sema3A修饰rGMSCs对大鼠骨缺损修复效能的影响。经标本大体观察、X线检查、石蜡切片HE染色、Masson染色分析,Sema3A修饰rGMSCs作为种子细胞的实验组大鼠骨缺损区有大量新骨生成,新生骨骨质致密、成熟,骨小梁排列整齐,修复效果明显优于对照组。结论1.构建携带Sema3A基因的慢病毒载体并转染rGMSCs,使得rGMSCs稳定高表达Sema3A,Sema3A转染对rGMSCs增殖活性和成骨能力起正向调节作用。2.Sema3A转染rGMSCs抑制破骨前体细胞的活化,具体表现在共培养条件下,升高OPG/RANKL 比值,抑制RAW264.7细胞的破骨向分化;siRNA降低Nrpl受体表达后,Sema3A转染rGMSCs对RAW264.7细胞的破骨向分化的抑制作用显著减弱。3.Sema3A修饰rGMSCs可显著提高大鼠骨缺损的修复效果。