目的:为进一步完善啮齿类动物类过敏试验方法和评价体系,选用形态学检测手段,从体外细胞、局部皮肤、整体动物对药物类过敏试验方法和检测指标进行研究,观察主要器官和组织肥大细胞（Mast Cell,MC）形态变化状况,分析MC脱颗粒率与给药浓度/剂量、症状反应及脱颗粒物质含量之间的相关性,旨在评价以形态学指标作为评定类过敏性补充指标的可行性,同时初步探索啮齿类动物类过敏反应的组织学机制。方法:1.细胞类过敏试验:取对数生长期RBL-2H3细胞或P815细胞,重悬后,RBL-2H3细胞稀释至细胞浓度1×10~5个/ml,P815细胞稀释至0.5×10~5个/ml,接种96孔板,100μl/孔。培养箱中培养24h后,吸弃上清液,分别加入PBS液配制的各浓度C48/80受试药液,每浓度组设6个复孔,对照组设12个复孔,150μl/孔,作用30min后置倒置显微镜下观察细胞形态变化情况,计数每100个细胞中脱颗粒细胞数量,计算细胞脱颗粒率。同时取细胞上清液,检测其β-氨基己糖苷酶水平。并以细胞脱颗粒率为细胞形态学特征指标,以β-氨基己糖苷酶含量为评价细胞类过敏反应的参照指标,就两者的相关性进行分析。在此基础上,以Tween-80、碘海醇注射液、紫杉醇注射剂、注射用血塞通（冻干）和喜炎平注射剂为受试药品,对其在细胞类过敏试验方法中引入细胞形态学检查作为评价药物类过敏性附加指标的可行性及必要性进行考察。2.大鼠皮肤类过敏试验:以C48/80为工具药,于大鼠背部脊柱两侧皮内注射后立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液,15 min后麻醉处死,剪取背部皮肤测量蓝斑直径,摘取蓝斑皮肤观察其中MC的形态学变化,计算MC脱颗粒率,并以MC脱颗粒率为细胞形态学特征指标,以皮肤蓝斑直径为评价皮肤类过敏的参照指标,就两者的相关性进行分析。在此基础上,再以Tween-80、碘海醇注射液、紫杉醇注射剂、注射用血塞通（冻干）和喜炎平注射剂为受试药品,就其对在大鼠皮肤类过敏试验方法中引入细胞形态学检查作为评价药物类过敏性附加指标的可行性及必要性进行考察,并就其引起皮肤类过敏反应的组织学机制进行探讨。3.全身类过敏试验:以C48/80为工具药,分别给啮齿类动物大鼠、小鼠、豚鼠静脉注射,根据机体内MC分布特点,10min后摘取气管、肺、皮肤、胃、大肠组织,HE及甲苯胺蓝染色,镜下观察各组织及其MC形态变化,以MC数和脱颗粒率为组织形态学特征指标,以全身类过敏反应症状、血浆中组胺水平变化为评价全身类过敏反应的参照指标,就两者的相关性进行分析,筛选并确定适宜于以形态学方法检查的实验动物种属及靶器官靶组织。在此基础上,以Tween-80、碘海醇注射液、紫杉醇注射剂、注射用血塞通（冻干）为类过敏反应阳性药品,就其对在啮齿类动物全身类过敏试验方法中引入组织形态学检查作为评价药物类过敏性附加指标的可行性进行考察,并就其引起全身类过敏反应的组织学机制进行探讨。结果:1.细胞类过敏试验方法:类过敏阳性物质C48/80致RBL-2H3或P815细胞类过敏反应的形态学特征:（1）RBL-2H3细胞为贴壁细胞,细胞贴壁生长,形态观察适宜;P815细胞为半悬浮细胞,给药后细胞多悬浮于培养皿中,有流动性,形态观察影响因素较多。（2）给药后RBL-2H3细胞或P815细胞脱颗粒率明显升高。（3）RBL-2H3细胞脱颗粒率与C48/80浓度、β-氨基己糖苷酶OD值或释放量呈高度正相关,P815细胞脱颗粒率与C48/80浓度、β-氨基己糖苷酶OD值或释放量虽呈正相关,但无统计学意义。注射剂类药物及辅料对细胞类过敏试验的适用性考察:（1）Tween-80、碘海醇、紫杉醇、血塞通各浓度组RBL-2H3细胞、P815细胞脱颗粒率均显著增高;喜炎平各浓度组RBL-2H3细胞、P815细胞脱颗粒率变化不明显。（2）Tween-80、碘海醇、紫杉醇、血塞通各浓度组RBL-2H3细胞脱颗粒率与其浓度或β-氨基己糖苷酶OD值或β-氨基己糖苷酶释放皆呈高度正相关,而P815细胞脱颗粒率虽与以上药物浓度或β-氨基己糖苷酶OD值或释放量均呈正相关,但无统计学意义。2.大鼠皮肤类过敏试验方法:类过敏阳性物质C48/80致大鼠皮肤类过敏反应的形态学特征:（1）皮内注射后,大鼠皮肤MC脱颗粒率随浓度增加而升高,但MC数量无明显变化。（2）大鼠皮肤MC脱颗粒率与C48/80给药浓度或皮肤蓝斑直径呈高度正相关。注射剂类药物及辅料对大鼠皮肤类过敏试验的适用性考察:（1）Tween-80、碘海醇注射液、紫杉醇注射剂、注射用血塞通（冻干）皮内注射后,大鼠皮肤MC脱颗粒率均随浓度增加而升高。喜炎平注射液皮内注射后,大鼠皮肤MC脱颗粒率和皮肤蓝斑直径均未见明显变化。（2）Tween-80、碘海醇注射液、紫杉醇注射剂、注射用血塞通（冻干）组大鼠皮肤MC脱颗粒率与其给药浓度或皮肤蓝斑直径呈正相关。3.全身类过敏试验方法:类过敏阳性物质C48/80致啮齿类动物全身类过敏反应的组织学特征:（1）大鼠、小鼠和豚鼠气管、肺、皮肤、胃、大肠组织中MC数量无明显改变;（2）大鼠、小鼠气管、皮肤、胃组织形态学变化明显大于豚鼠,其中又以气管、皮肤组织MC脱颗粒率升高特征性最强;（3）气管、皮肤组织中MC脱颗粒率与C48/80剂量以及动物全身类过敏症状强度和血液生物标志物组胺水平均呈高度正相关。注射剂类药物及辅料对大鼠、小鼠全身类过敏试验的适用性考察:（1）大鼠、小鼠气管、皮肤组织对Tween-80、碘海醇、紫杉醇、血塞通4种受试物均属敏感,虽气管、皮肤组织对不同受试物敏感性强弱有所不同,但趋势一致;（2）气管、皮肤组织中MC脱颗粒率与受试物剂量以及全身类过敏症状强度或血液生物标志物组胺水平均呈中、高度正相关。结论:1.细胞类过敏试验方法:类过敏阳性物质和注射剂类药物及辅料体外直接给药,RBL-2H3细胞或P815细胞均呈明显的脱颗粒状态,其脱颗粒率与受试物浓度、细胞培养上清液中脱颗粒物质β-氨基己糖苷酶含量呈高度正相关。以RBL-2H3细胞脱颗粒率为指标,其显示出的对类过敏阳性受试药品的稳定性明显优于P815细胞。2.大鼠皮肤类过敏试验方法:类过敏阳性物质和注射剂类药物及辅料皮内注射给药,大鼠皮肤组织中MC呈明显的脱颗粒状态,其脱颗粒率与受试物浓度及皮肤蓝斑直径呈高度正相关。其组织学机制是由于类过敏阳性物质致局部皮肤MC脱颗粒,皮肤类过敏反应发生的主要物质基础是MC脱颗粒而释放的活性物质。3.全身类过敏试验方法:类过敏阳性物质和注射剂类药物及辅料静脉注射给药,大鼠、小鼠气管、皮肤、胃组织形态学变化明显大于豚鼠,其中又以气管、皮肤组织MC脱颗粒率升高特征性最强。全身类过敏反应,组织学机制是由于类过敏阳性物质致靶器官MC脱颗粒,全身类过敏反应发生的主要物质基础是MC脱颗粒而释放的活性物质,其反应特征为气管、皮肤组织中MC脱颗粒率与受试物剂量以及动物全身类过敏症状强度和血液生物标志物组胺水平均呈高度正相关。4.“细胞-皮肤-整体”类过敏试验组合评价体系中引入MC脱颗粒率等形态学检查指标,与原有功能性检测指标相比,具有直观性好、敏感性高、特异性强、抗干扰性高的特点,可作为一项补充指标应用于大鼠和小鼠类过敏试验评价方法中。