论文部分内容阅读
甲壳素是由β-1,4-糖苷键相连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基组成,是甲壳类动物（如虾,蟹和贝类）外骨骼的主要组成成分。甲壳素是一种可再生的原料,自然界每年生物合成的甲壳素约有1000亿吨之多约,其产量仅次于纤维素,是自然界中第二丰富的天然生物聚合物。甲壳素作为一种新型功能材料,在各个领域引起了广泛关注。但是它不溶于水和大多数有机溶剂,这种性质严重地限制了它的开发和应用。甲壳素可通过完全脱乙酰化或部分脱乙酰化并水解转化为壳寡糖（COS）。COS是一种结构多样的功能性生物聚合物家族。COS的结构可用三个来描述参数:聚合度（DP）,乙酰化程度（DA）和乙酰化模式（PA）即GlcN和GlcNAc的排列顺序。虽然我们对COS分子中DP和DA的结构功能关系有了基本的了解,但对PA的影响知之甚少。由于缺乏具有特定PA的COS和合适的分析方法,COS的PA的难以通过实验解决,因此阐明壳聚糖的乙酰化模式和分子结构与功能之间的关系具有挑战性。且化学法生产的壳聚糖总显示出随机的乙酰化模式,相反,由几丁质脱乙酰酶（CDA）产生的COS可具有特定的乙酰化模式,如一些细菌CDA所示。然而,与我们对细菌CDA的了解相比,我们对真菌CDA产生具有特定乙酰化模式的COS知之甚少。本论文从CAZY数据库中调研得到来源于糖苷水解酶第四家族（Carbohydrate Esterase Family 4,CE 4）的几丁质脱乙酰酶（CDA）。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为研究对象,表征了来自酿酒酵母的几丁质脱乙酰酶（ScCDA2）详细的脱乙酰化机制并对它的反应产物（部分乙酰化的壳寡糖）进行了分离。实验表明ScCDA2可以产生完全确定的COS解决了化学生产的壳寡糖乙酰化模式的随机化。ScCDA2还分别对结晶几丁质和胶体几丁质表现出约8%和20%的脱乙酰活性。此外,开发了一种通过高效液相色谱和电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）系统分离和检测部分乙酰化壳聚糖寡糖的方法,该方法快速方便,可在线监测。质谱测序显示,ScCDA2分别产生具有DAAA,ADAA,AADA,DDAA,DADA,ADDA和DDDA的特异性乙酰化模式的COS。因此,Sc CDA2不会使最靠近低聚物还原端的GlcNAc单元去乙酰化,ScCDA2对几丁质寡糖具有多重攻击的催化机制。这种特定的作用模式显著地丰富了现有的几丁质脱乙酰酶脱乙酰化模式库。这些完全定义的COS可用于COS结构和功能的研究。