蒙古马卵巢发育规律及调控机理研究

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马属动物是一种繁殖周期较长的季节性单胎动物,其独特的繁殖生理结构特性是当下影响马属动物繁殖效益和相关繁殖技术开发应用的主要因素之一。卵巢作为雌性动物生殖系统中的核心器官,在神经系统和内分泌系统的作用和调节下,具有周期性产生卵子和分泌生殖激素的功能。然而由于排卵窝这一独特结构的存在,马属动物卵巢结构、发育、排卵和调控明显不同于其他家畜动物。目前为止,国内外鲜有对马卵巢发育规律与调控分子机理开展研究相关的报道。因此,本研究以蒙古马(胎儿时期、成年时期)为实验对象,基于前人对马属动物卵巢组织结构、激素调控等研究基础上,进行了组织学形态观察研究,并通过转录组学、定量PCR、免疫组化等手段对可能与卵巢发育相关的候选基因进行了筛选和确定解析了不同发育时期蒙古马卵巢活跃基因的差异和由此产生的功能差异,以期为在开展马属动物繁殖机理与技术研究的同行提供基础数据和理论帮助。该研究我们得到的主要结果如下:1.拥有高效的蒙古马组织学研究体系是开展后续分子调控机制研究所不可或缺的条件之一,然而蒙古马卵巢形态学研究显示马卵巢结构特殊,其髓质和皮质反转,这导致马卵巢石蜡切片的制作无法直接借用其他哺乳动物的制作体系。并且,我们大量的预实验表明有必要首先针对蒙古马卵巢进行组织切片制作体系的优化。本研究以2岁蒙古马为研究对象,通过对比不同固定方法,组织脱水方法,浸蜡方法及苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色体系对石蜡切片制作效果的影响,探索了马卵巢制作最优体系。经过对比,确定小于0.5 cm组织片段采用Bouin固定液进行75%酒精浸泡24 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h脱水;二甲苯透明剂中放置10 min×2次;纯蜡与二甲苯按1∶1比例混合并浸蜡40 min→纯蜡Ⅰ40min→纯蜡Ⅱ0.05 Mpa真空浸蜡40 min条件为制作马卵巢组织石蜡切片的最佳体系。2.本研究以蒙古马为研究对象,通过对胎儿期、成年时期母马卵巢采用转录组测序,将所得数据进行差异表达基因筛选,并对其进行GO功能分析和KEGG数据库富集。结果表明,我们成功构建蒙古马胎儿时期与成年时期6个高质量RNA测序文库。基于公共平台上Equ Cab 3.0基因组进行分析,筛选出6334个差异表达基因,这些基因主要涉及lipid metabolic process(脂质代谢过程),lipid biosynthetic process(脂质生物合成过程),steroid metabolic process(类固醇代谢过程)等过程,Cushing syndrome(皮质醇增多症),Cortisol synthesis and secretion(皮质醇的合成与分泌),Aldosterone synthesis and secretion(醛固酮合成与分泌),Steroid biosynthesis(类固醇生物合成)等信号通路。3.由于在以上结果中我们注意到很多关于类固醇激素合成相关重要基因如CYP11A1、CYP17A1、HSD17B7、LDLR、SCARB1和STAR在蒙古马胎儿时期卵巢中高表达,且差异显著,这与其他动物上所报道的情况大有不同。因此,我们进一步通过RT-q PCR和免疫组化方法检测了部分蒙古马卵巢类固醇合成相关基因的m RNA表达量和蛋白表达量,结果与转录组测序表达趋势一致,因而我们推测上述基因表达差异可能与母马妊娠和胎儿卵巢发育关系密切。
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