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铝是地壳中含量第三丰富的元素,当土壤pH低于5.5时,土壤中的铝就会从非游离状态转变为更高活性的游离状态,植物根系严重中毒。有机酸在根中的分泌在植物的铝耐受性中过程中起着关键。在铝胁迫条件下,由苹果酸、柠檬酸等根分泌的有机酸可以螯合Al3+离子并形成不会进入根部的无毒化合物,从而实现耐铝性。苹果酸转运蛋白ALMT1和柠檬酸转运蛋白MATE在这一过程中起着重要作用。转录因子是一类能显著调控植物生长和发育的蛋白质并在植物防御和应激反应中发挥重要作用的蛋白质。WRKY主要参与植物的生物胁迫,如:病原体的防御等和非生物胁迫包括诸如伤害、干旱、盐度、热、冷和渗透压等。迄今为止,WRKY在植物铝耐性方面的研究比较少。近期有研究发现拟南芥WRKY46和水稻WRKY22分别通过调控ALMT1和水稻柠檬酸转运体OsFRDL4,进而调控了它们的耐铝性。我们前期转录组数据显示铝诱导了根中WRKY28和WRKY29的表达,且T-DNA插入突变体wrky28和wrky2显示出对铝敏感性增加。为了进一步明确WRKY28和WRKY29在铝耐性中的调控机理,本研究结合生理、生化、细胞、遗传学和分子生物学等手段,对此进行了详细的探讨。具体研究结果如下:(1)使用QRT-PCR分析,我们发现所订购的两个T-DNA插入突变体均为功能获得性突变体。与此同时我们构建并获得了WRKY28和WRKY29过表达转基因材料,发现与野生型相比,过表达株系均表现出对铝耐性的降低,并且高于T-DNA插入突变体。因此,鉴于本研究未能获得功能缺失性突变体,我们利用WRKY28和WRKY29过表达株系进一步展开了下一步研究。(2)结合不同金属离子(La3+、Cd2+、Cu2+)胁迫和不同pH胁迫处理,我们发现WRKY28和WRKY29未参与到拟南芥根系对La3+、Cd2+和低pH胁迫耐性的调控过程中,但却参与了对Cu2+耐性胁迫的调控。这表明WRKY28和WRKY29对铝耐性的调控不具有专一性,也参与了对其它金属离子胁迫的调控。(3)QRT-PCR分析表明,铝胁迫显著诱导了WRKY28和WRKY29在根系中的表达,且随着胁迫时间的增加,他们表达量也逐渐增加。为了明确铝胁迫下WRKY28和WRKY29在根尖部位的表达变化,我们构建并获得WRKY28pro:GFP和WRKY29pro:GFP。结果发现WRKY28 和 WRKY29 主要在根尖根冠细胞中表达,铝胁迫诱导了这两个基因在根尖细胞的表达。但这种诱导并非是对铝胁迫专一的,Cu2+胁迫也诱导了它们在根尖细胞中的表达,但La3+、Cd2+和低pH并未影响它们在根尖细胞的表达。(4)Morin染色定性分析和利用石墨炉-原子吸收分光光度计定量分析均显示WRKY28和WRKY29过表达株系根尖部位积累了更多的铝。(5)与野生型相比,铝胁迫下WRKY28和WRKY29过表达株系苹果酸的分泌速率显著降低。使用QRT-PCR分析,发现过表达株系中ALMT1的表达水平显著降低。这表明WRKY28和WRKY29对铝耐性的调控是通过对ALMT1介导的根系苹果酸分泌的调控。酵母单杂交实验结果显示,WRKY28和WRKY29不能够直接结合到ALMT1启动子区调控其表达,但拟南芥叶片原生质体瞬时表达实验结果则表明,在铝胁迫存在的情况下,WRKY28和WRKY29则能够直接结合到ALMT1启动子区域调控其表达,且WRKY28和WRKY29对ALMT1转录表达的调控具有叠加效应。进一步使用酵母双杂交和双分子荧光互补技术,发现WRKY28和WRKY29之间存在强烈的相互作用。这表明WRKY28和WRKY29能够通过形成蛋白复合体的形式相互作用共同调控ALMT1的表达。(6)研究中发现,铝胁迫下,STOP1位于WRKY28、WRKY29和WRKY46的上游,抑制它们的转录表达。而WRKY28和WRKY29则能够抑制WRKY46的表达。同时我们还发现,与野生型相比,铝胁迫下WRKY28和WRKY29过表达株系中MATE表达量下降,WRKY29过表达株系中ALS3和ALS1的表达量也下降。这表明,和WRKY46不同,WRKY28和WRKY29对铝耐性的调控还可能通过其它途径来完成。至于具体相关途径是否也参与了WRKY28和WRKY29对铝耐性的调控,下一步将具体进行分析。综上,本研究揭示WRKY28和WRKY29参与了对铝耐性的调控,但这种调控并非铝离子专一性。WRKY28和WRKY29主要通过共同调控ALTM1介导的根系苹果酸的分泌来调控铝耐性,且STOP1位于WRKY28、WRKY29和WRKY46的上游抑制它们的表达。