1研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种常见的自身免疫性疾病,病因未明,许多研究表明SLE的多基因异常表现在多能造血干细胞基因水平的异常,在基因和环境因素的作用下,分化出异常的T、B淋巴细胞,由此提出SLE属于多克隆异常干细胞病的理论。目前仍未找到根治SLE的方法,患者需终身服用糖皮质激素。但长期用药所引起的副作用极大地影响患者的生存质量和生存率。在我国,长期的临床实践证明中西医结合治疗SLE可明显减少西药的副作用,目前学者们从细胞因子、细胞凋亡、免疫细胞以及下丘脑—垂体—内分泌轴等方面对中医药治疗SLE的疗效和机理进行了研究,思路基本是沿着现代医学对其发病机制的研究来进行。因此,利用更先进的分子生物学技术结合传统中医理论从分子水平上阐述中药复方的作用机制是目前的研究趋势。蛋白质组学技术不但可以鉴定自身免疫病的整个自身抗体模式,而且可研究自身免疫的多样性;另外,蛋白质组学技术能有效地鉴定自身免疫反应的自身蛋白质靶点,绘制出免疫优势的抗原决定簇图谱。表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI—TOF-MS)为美国赛弗吉公司开发的集蛋白质芯片和质谱于一身的蛋白质组学先进技术,检测结果通过分析软件处理可获得样品中各种蛋白质的信息如分子量、含量等,并进行差异性分析,从而寻找有意义的标志物或质谱图谱。我们科室多年来一直从事的SLE的中医研究,认为肾阴不足,阴虚内热是SLE的基本证型,滋肾养阴清热法是治疗SLE的基本法则,前期研究已证明:滋阴清热方治疗SLE能减少患者的激素用量及减轻激素的副作用。并且2004年申报的国家自然科学基金课题《滋阴清热方影响阴虚内热证SLE白细胞基因及蛋白质表达模式的动态研究》已结题,研究表明:阴虚内热证SLE患者细胞凋亡相关基因、免疫相关基因等的表达紊乱,治疗前、中、后基因表达模式和蛋白质表达有明显改变,提示滋阴清热方可能通过调节患者的基因表达和蛋白质的表达而达到治疗作用。本实验试图运用蛋白质组学技术从骨髓造血干细胞、淋巴细胞的核蛋白质组的表达去揭示滋阴清热方以及联合强的松治疗SLE发挥疗效的作用环节和机制。2目的本课题运用蛋白质组学技术检测不同干预处理组狼疮鼠的骨髓细胞、淋巴细胞的核蛋白质组的表达,比较各组的核蛋白质质谱的差异,试图揭示滋阴清热方以及联合强的松治疗SLE发挥疗效的作用环节和机制,与中医药临床研究相互补充,为滋阴清热方的疗效及作用机理提供科学客观的依据;同时为中西医结合治疗疾病的基础研究开辟一条新的研究道路和开创一种新的思维方法。3研究方法1)研究对象:31只雌性MRL/LPR狼疮鼠,体重25.5—35.5 g,平均30.6 g,2)治疗药物:滋阴清热方组成:山萸肉15生地20茯苓15泽泻15丹皮15青蒿8甘草63)试验方法:动物分组:31只雌性MRL/LPR狼疮鼠,根据体重分为4组:25g-27.9g;28g-29.9g;30g-32.9g;33g-35.5g,平均为30.5g。进行区组随机分为4组,模型对照组7只,强的松组、滋阴清热方组、滋阴清热方+强的松组各8只。用药方法和时间:A.模型对照组:生理盐水0.6ml,每日灌胃一次。B.强的松组:强的松为9mg/kg/d,用生理盐水配成混悬液0.6ml,每日灌胃。C.滋阴清热方组:中药剂量,共0.6ml(0.4 g)煎剂,每日灌胃一次。D.滋阴清热方+强的松组:强的松为7mg/kg/d,用生理盐水配成混悬液0.2ml;中药剂量共0.4ml(0.4 g)煎剂。每日灌胃一次。狼疮鼠用水及裸鼠饲料喂养至12周龄后,给予不同的干预治疗5周。死亡的小鼠剔除。4)取样品:取血清:取脾的淋巴细胞;取骨髓细胞。5)核蛋白质的提取6)用SELDI方法检测7)数据处理和分析8)蛋白质的对比分析方法4实验结果骨髓细胞核蛋白质的结果:1)对照组与西药组相比较,有统计学意义的差异表达蛋白峰15个(P＜0.05),其中属于对照组的蛋白峰值有11个,属于西药组的4个;对照组与中西药组相比较,其中有统计学意义的差异表达蛋白峰14个(P＜0.05),属于对照组的质荷比峰值有10个,属于中西药组的有4个。其中两者有10个相似或相同的蛋白质峰值。A.与西药组相比,对照组蛋白峰值在2555、2756、3048、3090、3406、4722、5076、10147、2907、5503、6480上有统计学意义。与中西药组相比,对照组质蛋白峰值在2556、2757、3050、3093、3409、4722、5078、10152、4479、6510上有统计学意义。上两者有8个相似或相同的蛋白质峰值,不同的峰值在2907、5503、6480和4479、6510。重点在查找这5个峰值所对应可能的蛋白质的差异。对照组/西药组的对照组2907、5503、6480峰值所代表的蛋白质主要是一些内源性的抗菌肽、与胃肠道有关的肽类。对照组/中西药组的对照组4479、6510峰值所代表的蛋白质主要是一些内源性的抗菌肽、与胃肠道有关的肽类、神经内分泌肽类。B.与对照组相比,西药组质荷比峰值在3063、10252、10476、13092上有统计学意义。与对照组相比,中西药组质荷比峰值在11159、12228、10480、13098上有统计学意义。上2者有2个相似的蛋白质荷峰值。不同的峰值在3063、10252和11159、12228。重点在查找这4个峰值所对应可能的蛋白质的差异。西药组3063、10252的峰值所代表的蛋白质主要是一些调节免疫活性、细胞凋亡和免疫应答有关的肽类。中西药组11159、12228的峰值所代表的蛋白质主要是一些与细胞的分裂、血管的形成有关的肽类。2)中西药组和西药组直接比较:有统计学意义的差异表达蛋白峰1个(P＜0.05,其他蛋白峰均P＞0.1,属于西药组西药组的峰值所代表的蛋白质对淋巴细胞的增殖有抑制作用的,与免疫应答有关的肽类。3)中药组和西药组直接比较:有统计学意义的差异表达蛋白峰5个(P＜0.065),余蛋白峰均P＞0.1:3245属于中药组,属于西药组13073、13235、13276、13390。4)中药组和中西药组直接比较:有统计学意义的差异表达蛋白峰1个(P＜0.065)余蛋白峰均P＞0.1,属于中西药组.5)对照组与中药组相比较,有统计学意义的差异表达蛋白峰3个(P＜0.05):2557、3247、5078.中药组的峰值所代表的蛋白质主要是一些内源性的抗菌肽类脾淋巴细胞核蛋白质的结果:1)对照组与西药组相比较,共找出有统计学意义的差异表达蛋白峰17个(P＜0.05),属于对照组蛋白峰值有12个,属于西药组5个。对照组与中西药组相比较,共找出有统计学意义的差异表达蛋白峰12个(P＜0.05),属于对照组蛋白峰值有5个,属于西药组7个。A.与西药组相比,对照组蛋白峰值在2896、2953、3080、3100、2917、2784、2967、3053、3158、3842、8458、8658上共12个有统计学意义。与中西药组相比,对照组蛋白峰值在2899、2956、3083、3101、4237上共5个有统计学意义。上2者有相似的蛋白峰值4个。重点在查找不同的蛋白峰值2917、2784、2967、3053、3158、3842、8458、8658和4237对应可能的蛋白质的差异。对照组/西药组的对照组2917、2784、2967、3053、3158、3842、8458、8658的峰值所代表的蛋白质主要是一些与胃肠道有关的蛋白质酶类、内源性的抗菌肽和神经内分泌系统的肽类。对照组/中西药组的对照组4237的峰值所代表的蛋白质主要是一些与胃肠道有关的蛋白质酶类、内源性的抗菌肽。B.与对照组相比,西药组质荷比峰值在3699、5327、5405、12335、12418上共5个有统计学意义。与对照组相比,中西药组质荷比峰值在6526、6551、6580、6605、6705、6724、12235上共7个有统计学意义。查找3699、5327、5405、12335、12418和6526、6551、6580、6605、6705、6724、12235对应可能的蛋白质的差异。西药组3699、5327、5405、12335、12418的峰值所代表的蛋白质主要是一些与细胞周期和转录有关的肽类、内源性的抗菌肽和与抑制α-TNF的肽类。中西药组6526、6551、6580、6605、6705、6724、12235的峰值所代表的蛋白质主要是一些与细胞有氧呼吸有关的肽类、内源性的抗菌肽和神经内分泌系统的肽类。2)西药组与中西药组比较,其中有统计学意义的差异表达蛋白峰(P＜0.066)有2个,余蛋白峰均(P＞0.1)。属于西药组:4150、6186。3)中药组与西药组相比较,其中有统计学意义的差异表达蛋白峰7个(P＜0.065),属于中药组蛋白峰值有:3053、4285、8610,属于西药组个5403、4106、6028、9977。4)中药组与中西药组,其中有统计学意义的差异表达蛋白峰4个(P＜0.07)属于中西药组蛋白峰值:6579,6629,属于中药组4232,4289。5)对照组与中药组相比较,共找出有统计学意义的差异表达蛋白峰7个(P＜0.06)。与中药组相比,对照组质荷比峰值在2951、3889、3902、8486上共4个有统计学意义(P＜0.06);与对照组相比,中药组质荷比峰值在5691、6573、8560上有统计学意义(P＜0.06)。查找2951、3889、3902、8486和5691、6573、8560对应可能的蛋白质的差异。对照组的2951、3889、3902、8486峰值所代表的蛋白质主要是一些内源性的抗菌肽、与引起血管扩张的肽类以及与病毒和紫外线有关的肽类。中药组5691、6573、8560的峰值所代表的蛋白质主要是一些与肌动蛋白、细胞的有氧呼吸、染色质结构的维持DNA修复等有关的肽类。5结论1)应用强的松和或中药后对狼疮鼠的骨髓细胞和脾淋巴细胞的核蛋白质均产生明显的影响,出现多个有意义的蛋白质荷峰值。提示强的松和或中药可能通过影响骨髓的多能造血干细胞的分化和蛋白质的表达达到治疗的目的。与实验的假说是一致的:滋阴清热方治疗SLE可能是通过调控造血干细胞的相关易感基因的表达从而影响蛋白质(自身抗原)的表达。2)在对照组与西药组比较中,对照组的骨髓核蛋白质出现这样一些加重病情、增加细胞因子的蛋白质,西药组的骨髓核蛋白质出现一些参与调节免疫活性、拮抗细胞凋亡的蛋白质,提示强的松对狼疮鼠的作用机制可能在于抑制核因子-κB通道、增强肿瘤生长因子的功能,减少趋化因子和维持下丘脑-垂体-肾上腺轴稳态等方面抑制细胞的凋亡和增强线粒体的功能。3)中西药组和西药组骨髓细胞的核蛋白质直接比较发现有差异的蛋白质峰只有一个,所对应的蛋白质属于西药组。中西药组和西药组脾淋巴细胞的核蛋白质直接比较发现有差异的蛋白质峰有两个。说明中西药组和西药组对骨髓细胞和脾淋巴细胞的核蛋白质的影响结果是相似的。中西药组激素用量为西药组激素量的80%,从而提示治疗SLE用滋阴清热类中药和激素对骨髓细胞和脾淋巴细胞的核蛋白质的影响有协同作用,可以减少激素的用量而达到相似的治疗效果。我们预测,应用于SLE患者身上,对于初发者可以使用80%的原激素量和滋阴狼疮方中药联合治疗会收到与单纯服原激素量的同样效果。但须进一步的临床验证4)对照组与中药组骨髓细胞的核蛋白质直接比较,发现有统计学意义的差异表达蛋白峰(P＜0.05)的只有3个。中药组的峰值所代表的蛋白质主要是一些内源性的抗菌肽类。也就是找不到与狼疮鼠病情和疾病发展相关免疫方面的蛋白质,说明单纯用中药和单纯用生理盐水对疾病发展的相关免疫方面的影响差别不大,单纯中药对狼疮鼠骨髓细胞的影响可能在于刺激机体的内源性抗菌肽,增强机体的对致病菌免疫力。根据这个结果,单纯用中药对患者治疗效果不大,但须进一步的临床验证。5)从不同处理组的脾淋巴细胞和骨髓细胞的核蛋白质质谱比较中,发现大多数蛋白峰所对应的蛋白质是内源性的抗菌肽、消化道肽类、神经内分泌系统的肽类、细胞有氧呼吸有关的肽类、与细胞凋亡有关的肽类以及与细胞因子有关的肽类,但未能发现强的松和滋阴清热方中药单独或协同作用的作用途径和相关蛋白质的联系。SELDI蛋白质质谱技术是一种新生的技术,用来研究SLE的报道不多,因经费问题实验的例数又较少,也可能是导致发现不了各肽类的相关性的原因,在以后的研究中可考虑扩大实验例数。6)在本实验中还发现大量找不到相应蛋白质的质荷峰,这些峰值有待进一步的研究。