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目的本研究以IL-6为目标,通过一系列体内体外实验阐明IL-6是结肠癌耐药与其肿瘤微环境中CAFs细胞的重要关联之一,同时基于IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路探讨蟾毒灵逆转CAFs介导的结肠癌多药耐药的作用机制,为结肠癌的中西医结合治疗提供新的科学依据。方法1.采用胶原酶消化法分离和培养原代结肠CAFs细胞,通过显微镜进行形态学观察,采用Western blotting进行标志性蛋白检测;2.通过CAFs-肿瘤细胞交互模型(直接共培养、条件培养基间接作用)的CCK-8实验研究CAFs对结肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响;3.ELISA及RT-PCR检测结肠CAFs中IL-6的分泌情况;采用Western Blotting实验检测奥沙利铂干预下,CAFs细胞作用于肿瘤细胞后对IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路的影响;4.通过蟾毒灵作用于CAFs-肿瘤细胞交互模型(直接共培养)的CCK-8实验研究蟾毒灵对CAFs介导的结肠癌奥沙利铂耐药作用的影响;5.采用Western Blotting、ELISA实验研究蟾毒灵作用后对由CAFs激活的IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路的影响及对IL-6含量的影响;6.构建人源结肠肿瘤异种移植模型(共20只),随机分为生理盐水(NS)组,奥沙利铂(OXA)组,蟾毒灵(BU)组,奥沙利铂+蟾毒灵(OXA+BU)组,每组5只。用药结束后,测量每组肿瘤大小,取瘤组织切片,免疫荧光检测荷瘤组织中IL-6表达情况;抽取小鼠血清,ELISA检测血清中IL-6表达水平。结果1.显微镜下观察CAFs细胞形态及Western Blotting检测CAFs蛋白标志物,结果显示所提原代CAFs符合癌化成纤维细胞的特性;2.通过CCK-8、Western Blotting实验研究结肠CAFs对结肠癌细胞HCT116、HT29奥沙利铂耐药的影响,结果显示结肠CAFs细胞降低结肠癌细胞的奥沙利铂药物敏感性,帮助结肠癌细胞抵抗化疗药物的杀伤,促进耐药;3.通过IL-6 ELISA试剂盒及RT-PCR从蛋白与m RNA水平检测CAFs的IL-6的释放水平,结果表明来源于结肠癌微环境中的CAFs高表达IL-6,同时CAFs可以通过IL-6这一炎症因子,与结肠癌细胞上相应的受体作用,并激活IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路,参与结肠癌奥沙利铂耐药;4.通过CCK-8实验研究蟾毒灵对由CAFs介导的结肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响,结果表明蟾毒灵可以抑制由CAFs介导的结肠癌细胞奥沙利铂耐药,增强结肠癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性;5.通过蟾毒灵作用于CAFs-肿瘤细胞交互模型(直接共培养)后Western Blotting研究蟾毒灵对由CAFs介导的结肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响的分子机制,结果表明结肠癌细胞系HCT116、HT29在奥沙利铂干预时相关促凋亡蛋白明显上调,且IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路中相关蛋白明显下调,说明蟾毒灵通过抑制IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路逆转由CAFs介导的结肠癌细胞奥沙利铂耐药;IL-6 ELISA检测显示蟾毒灵可以抑制共培养体系下CAFs的IL-6表达,而不能直接抑制CAFs的IL-6释放;6.体内实验结束后,观察各组小鼠瘤体变化趋势,结果显示蟾毒灵联合奥沙利铂可以显著抑制小鼠肿瘤生长,同时通过小鼠血清IL-6含量测定及免疫荧光实验,结果显示蟾毒灵联合奥沙利铂可以明显抑制小鼠血清中IL-6表达水平及CAFs细胞的IL-6分泌,说明蟾毒灵通过抑制CAFs分泌的IL-6增强奥沙利铂的药物敏感性,抑制耐药。结论1.CAFs通过释放IL-6并激活STAT3/Bcl-2信号通路降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性;2.蟾毒灵通过抑制IL-6/STAT3/Bcl-2信号通路逆转由CAFs介导的结肠癌奥沙利铂耐药;3.蟾毒灵联合奥沙利铂可以显著抑制小鼠肿瘤生长、小鼠血清中IL-6表达水平及CAFs细胞的IL-6分泌,说明蟾毒灵通过抑制CAFs分泌的IL-6增强奥沙利铂的药物敏感性,抑制耐药。