肿瘤是全球范围内威胁人类生命健康的重大公共卫生问题。大量研究发现,肿瘤细胞中活性氧（ROS）产量增加并发生蓄积。此外,肿瘤细胞由于氧化还原体系失衡,相比正常细胞更接近ROS的毒性阈值,导致其更容易受到高浓度ROS损伤而死亡。因此基于肿瘤高水平ROS可实现肿瘤特异性诊断,以及通过大幅提升ROS浓度达到抗肿瘤效果。其中过氧化氢（H₂O₂）作为ROS的主要组成成分,可作为肿瘤特异性诊断和治疗的主要靶标。当前针对ROS的光学成像技术以及光动力疗法（PDT）由于其非侵袭性以及方便快捷等优点受到广泛关注,但二者都面临光源穿透深度限制以及所用材料生物安全性差等问题,限制了两者的应用和转化。在课题组前期研究基础上,本课题提出利用化学发光小分子鲁米诺、二代光敏剂二氢卟吩e6（Ce6）以及具有良好生物相容性的聚乙二醇（PEG）,共同构建过氧化氢响应性纳米粒CLP NP。借助肿瘤异常升高的H₂O₂和化学发光共振能量转移效应（CRET）,实现针对肿瘤的近红外自发光成像和无需外界光源激发的光动力治疗,从而为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和实验依据。方法1.两亲性材料CLP的合成与表征用EDC/NHS活化Ce6后,先后加入鲁米诺和mPEG-NH₂进行缩合反应。反应结束后透析、过滤、冻干即得两亲性材料CLP。分析其红外图谱、氢谱、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱以及二维和三维光学图谱。2.过氧化氢响应性自发光纳米粒CLP NP的制备及表征取两亲性材料CLP充分溶解在水溶液中,即得自组装纳米粒CLP NP。对其粒径、Zeta电位、形貌特征、荧光强度变化、不同溶剂中氢谱进行检测。并观察不同稀释程度、溶剂及孵育时间对粒径的影响。3.理论计算及实验验证CLP NP的自发光性能BPCL-2-KGC微弱发光检测仪对比CLP NP、Ce6-PEG、鲁米诺钠在H₂O₂氧化下化学发光强度。通过Gaussian 09程序得到简化分子Ce6-Luminol的优化几何构型,并计算Ce6共轭单元与鲁米诺苯环结构距离最近的两原子间的直线距离。对比Ce6吸收光谱和鲁米诺钠自发光光谱的重叠情况。CLP NP或鲁米诺钠与H₂O₂混合后,活体成像系统（IVIS）检测加不同光栅前后的自发光强度变化。4.不同因素对CLP NP自发光的影响首先,使用BPCL-2-KGC微弱发光检测仪检测纳米粒浓度及H₂O₂浓度对CLP NP自发光强度的影响。其次,使用IVIS检测CLP NP在病理水平H₂O₂浓度（0-100μM）下的自发光成像优势。而后,检测抗氧化剂NAC或GSH以及表面活性剂SDS对CLP NP自发光的影响。5.各细胞株胞内H₂O₂水平测定收集各细胞株,探头超声破碎后高速离心取上清。检测上清液中H₂O₂及蛋白含量。6.CLP NP在体外细胞水平的自发光成像能力检测首先,检测纳米粒剂量及孵育时间对4T1摄取CLP NP行为的影响。然后,对比CLP NP与4T1、HCT116和A549细胞孵育后的自发光强度。而后,检测细胞数量、纳米粒浓度以及各种抑制剂对CLP NP自发光影响。7.不同皮下瘤模型中肿瘤组织的H₂O₂检测构建4T1、HCT116和A549皮下瘤模型。取一部分瘤块做冰冻切片,按冰冻切片过氧化氢检测试剂盒要求染色;剩余瘤块制备匀浆上清液并检测H₂O₂含量。8.CLP NP在4T1皮下瘤模型中的自发光成像能力观测首先,在正常鼠皮下注射CLP NP、4T1皮下瘤模型鼠瘤内注射CLP NP或鲁米诺钠,检测自发光和荧光强度随时间的变化。其次,取4T1皮下瘤模型鼠的主要脏器、肌肉和肿瘤组织制备匀浆上清液,并与CLP NP或鲁米诺钠混匀后对比自发光强度。最后,取4T1皮下瘤模型鼠,在瘤内注射CLP NP前2 h先在瘤内注射NAC,观察对CLP NP的自发光和荧光的影响。9.理论计算及实验验证CLP NP中单线态氧的产生通过Gaussian 09计算简化分子Ce6-Luminol激发态的单重态S₁和三重态T₁之间的能量差。利用SOSG探针检测纳米粒浓度以及H₂O₂浓度对CLP NP产生单线态氧（¹O₂）的影响。10.CLP NP对肿瘤细胞的毒性检测将4T1、HCT116以及A549细胞分别与CLP NP孵育4 h后,用DCFH-DA探针检测胞内ROS变化。MTT法检测4T1、HCT116以及A549细胞与不同浓度CLP NP孵育24 h后的存活率并计算半数致死量IC₅₀。11.通过尾静脉给药观察CLP NP对A549皮下瘤的治疗效果取A549皮下瘤模型鼠,尾静脉给予生理盐水、1 mg/kg顺铂、6 mg/kg顺铂或CLP NP溶液（Ce6单元浓度为25 mg/kg）,每三天给药一次并记录体重和肿瘤体积。第14天处死小鼠,取瘤块拍照称重,取血检测血常规及肝肾功,取主要脏器计算脏器指数。12.通过瘤内药观察CLP NP对A549皮下瘤的治疗效果取A549皮下瘤模型鼠,瘤内注射生理盐水或CLP NP溶液（Ce6单元浓度为3.25mg/kg）。每三天给药一次并记录小鼠体重和肿瘤体积。第30天处死小鼠,取血清测定肝肾功;取主要脏器计算脏器指数并进行H&E染色;取肿瘤进行拍照和称量,石蜡包埋用于后续实验。13.瘤内给予CLP NP对4T1皮下瘤中细胞ROS水平影响取4T1皮下瘤模型鼠,瘤内注射生理盐水或CLP NP溶液（Ce6单元浓度为3.25mg/kg）。7 h后处死小鼠,取出瘤块并制备单细胞悬液,DCFH-DA染色后送流式检测。14.瘤内给药观察CLP NP对4T1皮下瘤的治疗效果以及对肺转移抑制效果取4T1皮下瘤模型鼠随机分三组,瘤内注射生理盐水、含Ce6单元浓度为3.25mg/kg或6.5 mg/kg的CLP NP溶液。每三天给药一次并记录小鼠体重和肿瘤体积。第17天处死小鼠。取主要脏器计算脏器指数并进行H&E染色;取肿瘤组织拍照和称量后,石蜡包埋用于后续实验。肺组织经Bouin固定液浸泡或多聚甲醛固定H&E染色后观察转移病灶。15.CLP NP的抗肿瘤机制初步探索CLP NP与A549细胞共孵育后,检测细胞凋亡、线粒体靶向聚集、线粒体膜电位变化以及凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、caspase-8的活化情况。16.CLP NP在小鼠体内药动学研究雄性BALB/c小鼠尾静脉注射CLP NP溶液（Ce6单元浓度为3.25 mg/kg）。不同时间点处死小鼠,收集血液及主要脏器,或用代谢笼收集尿液及粪便,处理后用HPLC测定CLP NP含量。17.CLP NP的中长期安全性评价实验分为两个阶段,第一阶段为给药干预期,BALB/c雄鼠尾静脉给予生理盐水或不同剂量CLP NP溶液（Ce6单元浓度分别为25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）,每三天给药一次,记录小鼠体重和观察小鼠状态。第30天每组处死5只小鼠,检测其脏器指数、血常规、肝肾功、脏器与淋巴结的H&E切片。第二阶段为恢复期,正常喂养,不再给药,第58天处死剩余小鼠,检测指标同第一阶段。结果1.通过化学缩合反应构建两亲性材料CLP,并通过多种手段表征其成功合成。2.自组装构建过氧化氢响应性自发光纳米粒CLP NP,粒径为178±3 nm,Zeta电位为-7.7±0.3 mV。TEM观察呈圆形核壳样结构。荧光强度及氢谱检测结果展示出CLP NP溶液的胶束特性。一定范围内稀释及各种水性溶液对CLP NP粒径基本无影响。CLP NP在水可稳定保持4天。3.微弱发光检测仪可以检测到CLP NP以及鲁米诺钠在H₂O₂氧化下产生的自发光,而Ce6-PEG不能检测到。理论计算简化分子Ce6-Luminol中Ce6共轭单元与鲁米诺苯环结构距离最近的两原子间的直线距离为0.6 nm,Ce6吸收图谱和鲁米诺自发光图谱有相当程度重叠,二者距离以及光谱匹配均适合发生能量共振转移。IVIS检测显示CLP NP在620-800 nm间不同波段的发光强度呈现一个以680 nm为峰值的波峰,而鲁米诺钠加光栅后均未检测到自发光。4.CLP NP的自发光强度与纳米粒浓度呈现一个先正相关后负相关的倒V形的关系;与H₂O₂浓度呈正相关。相对于鲁米诺钠,IVIS验证了CLP NP在病理H₂O₂浓度（0-100μM）下的自发光强度及成像时间优势。CLP NP自发光强度与抗氧化剂NAC和GSH浓度呈反比。表面活性剂SDS可在一定范围内增加CLP NP自发光与荧光强度。5.4T1细胞对CLP NP的吞噬呈现剂量和时间依赖性。CLP NP在细胞株中的自发光强度与胞内H₂O₂浓度、细胞数目、纳米粒浓度成正比;与广谱抗氧化剂NAC和GSH浓度、过氧化氢酶CAT浓度成反比;超氧阴离子抑制剂Tempol和羟自由基抑制剂SF对自发光强度影响不大。6.4T1、HCT116和A549三种皮下瘤瘤块中,4T1皮下瘤匀浆上清液中H₂O₂含量最高。相比鲁米诺钠,CLP NP在4T1皮下瘤模型及其各组织匀浆液中自发光强度及灵敏度更高,且具有自发光-荧光双重成像能力。抗氧化剂NAC预处理可以显著抑制CLP NP在肿瘤模型中的自发光成像能力,但对荧光成像无影响。7.理论计算得简化分子Ce6-Luminol激发态的单重态S₁和三重态T₁之间的能量差为0.855 eV,能够发生体系间跨越。SOSG检测到CLP NP的¹O₂产生具有纳米粒浓度及H₂O₂浓度依赖性。CLP NP可在短时间内显著提升肿瘤组织ROS水平。MTT实验发现CLP NP对各细胞株均呈现剂量依赖性毒性,且其IC₅₀值与其升高胞内ROS能力呈负相关。8.与阳性药物顺铂相比,CLP NP通过尾静脉给药不仅可以显著抑制A549皮下瘤生长的疗效,而且对小鼠的体重、血常规指标以及肝肾功指标均无显著影响,无不良毒副作用。通过瘤内注射给予剂量为尾静脉给药剂量13%的CLP NP,依然显示了对A549皮下瘤的显著抑制效果。9.通过瘤内注射CLP NP可显著提高肿瘤组织的ROS水平。瘤内注射CLP NP可抑制恶性转移瘤4T1乳腺癌皮下瘤模型的原发肿瘤生长,同时减少肺部转移瘤形成。肿瘤切片表现出增殖抑制、凋亡增加、血管减少的现象。10.与CLP NP共孵育后,A549细胞呈现剂量依赖性凋亡。CLP NP可靶向富集于A549线粒体,引起剂量依赖性的线粒体膜电位去极化、凋亡相关蛋白caspase-3以及caspase-9活化,对caspase-8的活化不明显。11.小鼠体内药动学研究发现,CLP NP在血浆中清除较快,分布于脏器中的纳米粒大部分被排出,一半左右的CLP NP以原型形式通过排泄物排出体外。中长期安全性实验表明各剂量CLP NP不会对小鼠各项指标造成不可逆的伤害。结论1.成功制备核壳结构纳米粒CLP NP。该纳米粒稳定性良好,在H₂O₂氧化下,基于鲁米诺单元的化学发光以及CRET效应,可激活Ce6单元,产生近红外自发光。2.基于肿瘤细胞及肿瘤组织高表达H₂O₂的病理特征,CLP NP可对肿瘤细胞株以及皮下瘤模型进行近红外自发光成像,特异性好、灵敏性及发光强度高。3.基于Ce6的光敏剂特性,激活的CLP NP可产生¹O₂发挥PDT直接杀伤作用。此外,CLP NP可通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、减少血管新生等方式抑制皮下瘤生长和转移。进一步研究发现CLP NP主要通过¹O₂引起线粒体毒性,导致肿瘤细胞线粒体膜电位去极化,以浓度依赖的方式激活线粒体介导的caspase内源性凋亡通路,从而导致肿瘤细胞的凋亡。4.尾静脉注射后,CLP NP可被机体有效清除,具有良好的生物安全性。综上所述,本课题构建了一个过氧化氢响应性自发光纳米粒CLP NP。从理论和实验两方面均验证了CLP NP中的CRET效应以及H₂O₂氧化下近红外自发光和单线态氧的产生。通过多种肿瘤细胞株和在体肿瘤模型,验证CLP NP在肿瘤病理性升高的H₂O₂氧化作用下的近红外自发光成像能力和PDT治疗能力,效果显著。该响应性纳米粒制备方式简便快捷,生物安全性良好,可望为肿瘤的成像和治疗提供新的手段和方法。