哺乳动物卵泡发育是一个复杂的生理生化过程,主要包括：原始卵泡的募集、腔前卵泡的发育、有腔卵泡的选择和生长及卵泡的成熟或闭锁。该过程受激素、生长因子、金属离子等多种因素控制,最终只有少数卵泡发育为优势卵泡并排卵,99%以上的卵泡发生闭锁。卵泡颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞,它对卵母细胞成熟、卵泡发育有至关重要的作用。伴随着哺乳动物卵泡生长和发育,颗粒细胞体积增大、数量增多并逐步分化和成熟。G蛋白偶联受体3(G protein-coupled receptor3, Gpr3)属于G蛋白偶联受体超家族成员。近年来的研究表明,Gpr3在小鼠和人的卵巢中通过Gs蛋白介导的下游通路调节卵泡的生长发育和卵母细胞的成熟。但Gpr3在猪卵巢中的表达规律及在卵泡颗粒细胞中的作用目前尚未见报道。因此,深入研究猪Gpr3在卵巢及卵泡发育过程中的表达规律,探索Gpr3信号通路在卵泡颗粒细胞中的作用及其调控机制,可以为哺乳动物繁殖性状的选育提供可能的理论基础,在提高家畜繁殖性能方面具有重要意义。本论文以三元商品猪为研究对象,采用电子克隆与传统克隆相结合的方法,利用RT-PCR和RACE技术,获得了猪Gpr3基因的全长序列和含有完整编码框的Gpr6及Gprl2的部分cDNA序列,并利用生物信息学方法对其结构及功能进行了系统的研究；利用实时荧光定量(real-time) PCR和免疫蛋白印迹(Western blotting)技术对Gpr3在组织及卵母细胞体外成熟过程中的表达规律进行了分析；利用免疫组织化学方法对猪胎儿期50、70和90(日龄)、新生1日龄及生后期25、35、70、140和180(日龄)9个阶段猪卵巢组织中Gpr3蛋白的表达进行了细胞定位；利用real-time PCR和Western blotting技术对不同日龄、不同品种卵巢及不同直径卵泡中Gpr3的表达规律进行了分析；利用构建的Gpr3真核表达载体及与GFP融合表达载体检测了Gpr3在人胚肾(HEK293)细胞中的亚细胞定位、组成性活性以及鞘脂类脂质对Gpr3组成性活性和受体内化作用的影响；采用RNAi技术敲减Gpr3,阻抑Gpr3介导的信号通路,利用MTT、流式细胞术、放射免疫测定(Radioimmunoassay, RIA)、real-time PCR等方法检测阻抑该信号通路对猪卵泡颗粒细胞的作用及其分子机制；采用超表达Gpr3的方式激活其介导的信号通路,利用MTT、流式细胞术、RIA、real-time PCR等方法检测超表达Gpr3后对猪卵泡颗粒细胞生长及分化的影响,主要研究结果如下：1用电子克隆和RACE的方法克隆了猪Gpr3基因的全长序列和含有完整编码框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列,GenBank登录号分别为HQ606483、HM777010和HM77711,并做生物信息学预测分析,结果表明：猪Gpr3基因的cDNA由2101个核苷酸组成,编码330个氨基酸,分子量为35.2kDa,位于第6号染色体,与牛、犬、人、黑猩猩、小鼠和大鼠的氨基酸相似性分别为96.4%,95.1%,94.9%,94.8%,90.0%和85.4%。它具有典型的七次跨膜结构域,存在多个潜在的磷酸化和糖基化修饰位点,表明它是一个功能活跃的跨膜蛋白,可能参与信号传导、细胞生长调控等过程。另外,猪Gpr3、Gpr6和Gpr12的蛋白序列比对及功能预测分析发现,它们彼此间具有高度的序列同源性和相似的潜在功能,将三者归为同一受体亚家族,称为Gpr3亚家族。2用real-time PCR和Western blotting的方法检测猪Gpr3基因的组织分布及在卵母细胞成熟过程中的表达模式,结果表明：猪Gpr3基因在大脑、小脑、下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、’肾脏、肌肉、脂肪、胸腺、卵巢、输卵管、子宫、睾丸、卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,但仅在脑、垂体、肝脏、脂肪、子宫和卵母细胞中大量表达,推测其在猪的神经系统及生殖系统发育和功能维持方面具有重要作用,可能参与猪的脂肪代谢。另外,Gpr3基因在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达量呈下降趋势,并且与卵丘扩散程度呈显著的负相关(r=-0.937,P<0.01),表明其可能对卵丘扩散和卵母细胞成熟具有重要作用。成熟促进因子(Maturation promoting factor, MPF)的调节亚基Cyclin B1基因在卵母细胞体外成熟前期的表达量较低(0-24h),后期显著的升高(24-44h),而催化亚基CDK1基因的表达水平在整个培养过程中保持相对稳定,说明MPF可能主要在卵母细胞体外成熟后期发挥作用。3用免疫组织化学方法检测Gpr3蛋白在9个阶段猪卵巢组织中的表达与定位,结果表明：在胎儿和新生期,Gpr3主要在卵母细胞巢中的卵原细胞、原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中表达；在生后期,Gpr3在腔前卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞层、卵丘细胞和卵母细胞胞质中表达,并且在卵母细胞中的表达量最高。另外,在成年猪卵巢的黄体中也有微弱的表达。Real-time PCR和Western blotting结果表明,Gpr3mRNA和蛋白在不同发育阶段猪卵巢中均有表达,表达量呈波浪状变化,在新生及出生后140日龄的表达量最高；在不同品种猪的卵巢中,Gpr3的表达量趋于一致,未见显著性差异；在不同直径猪卵巢卵泡中,Gpr3的表达量随着卵泡直径的增加而上升。猪Gpr3受体在卵巢中的细胞和时期特异性表达模式表明,其可能在猪卵泡发育和黄体形成过程中发挥重要作用。4为了探究Gpr3的性质功能并筛选其潜在的配体,我们构建了Gpr3真核表达载体及与GFP融合表达载体,用以检测Gpr3在人胚肾(HEK293)细胞中的亚细胞定位、组成性活性、鞘脂类脂质对组成性活性和受体内化的影响。结果表明：在HEK293细胞中,Gpr3的表达引起了腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)组成性激活,并且激活程度与完全激活Gs偶联受体的程度相似。而且,鞘氨醇1-磷酸(sphingosine1-phosphate, S1P)可以通过组成性激活的Gpr3受体进一步增加AC的活性。当在HEK239细胞中表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的Gpr3受体时发现,绿色荧光仅集中于细胞膜和亚细胞膜中。S1P处理后,通过荧光共聚焦显微镜可以观察到激动剂诱导的受体内化过程。而鞘氨醇(sphingosine, Sph)和鞘磷脂(sphingomyelin, Sphi)不具备以上功能。说明,Gpr3是组成性激活的G蛋白偶联受体,它的组成性活性及激动剂诱导的内化作用受到脂质调节者S1P的调控,表明S1P可能是猪Gpr3受体的潜在激动剂。5为了研究Gpr3信号通路在猪卵泡颗粒细胞中的作用,本研究从猪卵巢卵泡(3-5mm)内分离颗粒细胞(pGCs)进行体外培养。采用RNAi技术“沉默”Gpr3阻抑其介导的信号通路,以检测Gpr3受体在猪卵泡颗粒细胞生长及分化过程中的作用。结果表明：转染Gpr3特异性的siRNA后,能够有效地抑制颗粒细胞中Gpr3mRNA和蛋白的表达,成功地阻抑了Gpr3介导的信号通路。MTT、流式细胞术及RIA检测的结果表明,阻抑Gpr3信号通路能够促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,但对颗粒细胞中类固醇激素的合成没有影响。另外,阻抑Gpr3信号通路显著改变了Cyclin B1、 Cyclin D2、Bcl-2、Bax和Gprl2的表达(P<0.05),而对CDK1、CDK4、P450arom、 P450scc和Gpr6的表达没有影响(P>0.05)。6为了进一步明确Gpr3在猪颗粒细胞中的功能,我们在颗粒细胞中超表达了Gpr3受体,结果表明：超表达Gpr3能显著抑制颗粒细胞的增殖,增加G0/G1期细胞的百分含量,减少S期的细胞,同时降低细胞周期标志蛋白Cyclin B1和CDK1的mRNA表达；超表达Gpr3能显著增加颗粒细胞的凋亡比率,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达；超表达Gpr3促进了Gpr6的表达；然而,超表达Gpr3不影响雌二醇和孕酮的分泌,并且未显著改变P450arom和P450scc的表达。由此可见,Gpr3信号通路在调控猪卵泡颗粒细胞生长和凋亡过程中具有重要的作用,相关基因表达量的改变为进一步探索Gpr3受体在调节卵泡颗粒细胞生长及凋亡过程的中作用机制奠定了一定的基础。