神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，但神经系统再生能力有限。随着神经组织工程技术的发展，利用神经组织工程技术制作的各种支架，为神经损伤修复创造了有利条件。纳米纤维具有较大的孔隙率，可以模拟胞外基质形貌，尤其是定向纳米纤维能引导神经细胞的神经突触伸展，促进神经细胞分化，使得定向纳米纤维成为神经组织工程的一种良好的支架材料。蛋白质是生物体行使其功能的基本单位，细胞内的基因通过转录、翻译、修饰产生蛋白质后，才能最终行使相关功能。因此蛋白质组学的研究能更好地帮助人们了解机体内各项生理功能的产生机制。对于定向纳米纤维影响神经细胞分化的分子机理研究，目前主要是采用传统的分子生物学技术来研究，发现了单个或少量发挥重要作用的蛋白质，然而在蛋白质组学水平系统性分析定向纳米纤维对神经细胞的蛋白质谱影响的研究至今仍未见报道。　　本论文的目的是综合运用蛋白质组学技术和生物信息学方法，研究左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向纳米纤维对PC12细胞内蛋白质表达的影响，最终在蛋白质层次揭示PLLA定向纳米纤维对PC12细胞的影响。随后与本课题组前期的研究结果(mRNA表达谱和microRNA表达谱)进行联合分析，从mRNA-microRNA-蛋白质角度阐释PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化的分子机理。最后，将本论文的联合分析结果与本课题组其他研究的联合分析结果进行类比分析，探究microRNA在生物材料影响细胞行为过程中的作用机制。此外，本论文还采用人工合成的GRGDS五肽对整联蛋白在PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化的介导作用进行干扰，研究整联蛋白的介导机理。　　本论文的具体工作如下:　　1、采用静电纺丝法制备左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向纳米纤维，采用匀胶法制备PLLA薄膜。对三种材料进行了红外光谱分析、扫描电子显微镜(SEM)观察、接触角测定和力学性能测试的表征。结果表明，三种实验材料化学组成性质一致，均为PLLA;PLLA薄膜表面比较平滑，不定向/定向纳米纤维粗细均一且无串珠，直径分别为238.20±4.88nm和269.30±4.27nm，定向纳米纤维具有较好的取向性;经过处理后，三种材料的亲水性均逐步提升，有利于细胞的粘附;PLLA定向纳米纤维的弹性模量(1214.48±58.47MPa)远高于PLLA不定向纳米纤维的弹性模量(99.15±41.44MPa)，提高取向性后PLLA纳米纤维的韧性增强。　　2、将预分化48h的PC12细胞分别种植在PLLA薄膜（Control组）、PLLA不定向纳米纤维（RF组）和PLLA定向纳米纤维(AF组)上，随后对细胞进行细胞活力测定和细胞形貌（吖啶橙染色和扫描电镜）观察，并采用高内涵分析系统(HCS)测定三组材料表面的PC12细胞的突触长度。实验结果表明，和阴性对照组的细胞相比，三组材料表面的细胞活力在90％以上，表明细胞活力状况良好;PC12细胞在薄膜表面基本呈圆形，在两种纳米纤维表面则伸出突触，但在不定向纳米纤维表面其突触较短且向不同方向伸展，在定向纳米纤维表面的PC12细胞的突触长度沿纤维取向向外伸展，且长度明显大于Control组和RF组;HCS测定结果表明PLLA定向纳米纤维表面生长的单个细胞所含突触总长度平均值显著大于PLLA不定向纳米纤维组和PLLA薄膜组。以上结果说明PLLA定向纳米纤维更有利于PC12细胞的分化。　　3、采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学鉴定技术分别鉴定了预分化48h的PC12细胞接种于三种实验材料表面24h后细胞内的蛋白质表达信息，计算了每种蛋白质的相对丰度，并进一步分析了生长在PLLA不定向/定向纳米纤维表面的PC12细胞内蛋白质表达情况的差异。结果表明，相对于Control组，RF组和AF组分别有235和281种蛋白质发生差异表达。　　4、采用生物信息学方法对差异表达蛋白质进行了聚类分析、GO功能分析和生物学通路分析。结果显示，RF组中3个上调表达蛋白质涉及1个分化相关GO功能，4个下调表达蛋白质涉及2个分化相关GO功能;AF组14个上调表达蛋白质涉及3个分化相关GO功能。RF组和AF组差异表达蛋白质分别涉及8个和11个分化相关生物学通路。相对于RF组，AF组的分化相关差异表达蛋白质数量更多，且涉及的分化相关生物学通路更多。本论文通过Western Blot和乙酰胆碱检测实验对蛋白质组学鉴定和生物信息学分析结果进行了验证。　　5、对所得的蛋白质组学实验数据和小组前期得到的mRNA和microRNA表达谱芯片实验数据进行联合分析。结果表明，PLLA不定向纳米纤维组发生差异表达的mRNA、miRNA和蛋白质组学数据无匹配部分，而PLLA定向纳米纤维可能通过miR-24、miR-25、miR-92a、miR-19b、miR-183、miR-29a、miR-29c、miR-23b调控Dnajb12、Rhob、Wbp11、Hmgcs1、Hmgn2基因的表达，进而调控粘着斑信号通路和细胞骨架、基因表达、转运、加工合成、代谢、发育、应激等GO功能。最后，将本论文的联合分析结果与本课题组其他研究的联合分析结果进行类比分析，结果表明细胞内蛋白质的表达是由多个microRNA综合作用的结果，而且在此过程中有其他调控机制也发挥作用。　　6、通过基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学鉴定技术，发现种植在PLLA定向纳米纤维上的PC12细胞的整联蛋白受到GRGDS五肽干扰后，有250个蛋白质发生了差异表达，并且大部分与细胞分化相关的生物学通路发生了改变，表明整联蛋白对于PLLA定向纳米纤维诱导PC12细胞分化的过程中发挥了重要作用。再结合课题组前期mRNA表达谱和micorRNA表达谱技术联合分析了胞内mRNA、miRNA和蛋白质的表达情况，发现整联蛋白受到GRGDS干扰后，miR-23a和miR-23b可能通过抑制CASP7的表达来降低细胞的粘附能力，进而引起细胞凋亡。说明整联蛋白介导PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化过程主要通过影响细胞在纤维表面的粘附，进而对PLLA定向纳米纤维对PC12细胞的诱导作用进行调控。