目的：真菌性角膜炎(Mycotic keratitis)或称角膜真菌病（keratomycosis）为眼科一种较常见疾病，该病早期临床症状不典型，与细菌性角膜炎很难鉴别，故不容易早期确切诊断。近40多年来，真菌性角膜炎的发病率明显增加。其原因有：①角膜外伤后，外界真菌侵入而致病。②抗生素的应用，扰乱了细菌和真菌的共生现象。③局部应用皮质类固醇激素，使角膜组织抵抗力下降，促使真菌在角膜内增殖而致病。④代谢药和免疫抑制剂的应用，使宿主抵抗力下降。⑤农药和化肥的应用，使泥土中真菌发生某些变化，致病力增强。其常见致病菌菌株为镰刀菌，继之为青霉菌和曲霉菌。本病进展较快，若病情未得到及时控制，可致角膜穿孔，眼内炎，终致失明。因此，真菌性角膜炎的早期诊断和治疗成为当前迫切需要解决的问题。而治疗的成功与否及视力的恢复则取决于早期、快速、正确的诊断。然而，至今尚无一种可用于早期诊断的实验室方法。目前常用的实验室方法有真菌刮片镜检和培养。刮片法常有10％KOH湿片，Acridine orange 染色，乳酸棉酚兰染色（LPCB）， Gram染色，CFW（Calcofluor white）染色，而角膜刮片常会给病人带来一定的痛苦,真菌培养需时较长（约2周左右），且有被污染的可能性。国外有人用共焦显微镜进行动物实验及临床观察，但据报道共焦显<WP=4>微镜良好的成像功能需要病人的密切配合，任何微小的眼球运动都会使图像模糊，因此不适合于儿童、高度残疾和角膜穿孔的病人。角膜活检可用于角膜刮片镜检和真菌培养均阴性的情况下，但因其具有创伤性而使其应用受到限制。PCR方法具有敏感、特异而且快速的特点，自从其一诞生就深受人们的喜欢。而其中AFLP被认为是迄今为止最有效的分子标记技术。AFLP是PCR与RFLP相结合的一种技术，其基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段的选择性扩增，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接做为扩增反应的模板。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。理论上讲，不管所研究的基因组DNA有多么复杂，用AFLP都可以检测出任何DNA之间的多态性。目前，国内陈洪、朱立煌等用AFLP的方法对8种常见致病性念珠菌构建指纹图谱。作者用PstI单酶切基因组DNA，用两条AFLP引物扩增，结果8个菌种都得到了清晰的特异条带，且菌种间的指纹图谱具有明显差异。进一步选择临床上最常见的白念珠菌8株分别进行AFLP反应。结果显示白念珠菌种内各单株间存在DNA指纹图谱的差异，但这种差异小于念珠菌种间的差异，这一结果与李冬梅等人的RAPD对白念珠菌分型的结果相符。 Boekhout等人用AFLP对地理分布、血清型、生态来源上均不同的两种新型隐球菌进行基因分型。证实了每一种新型隐球菌都有3个AFLP基因型。并且两种菌中都有一个杂交种的基因型，作者认为该基因型的出现是由于抗真菌药物的应用，使新型隐球菌改变了其毒力及对抗真菌药物的易感性，从而其遗传物质发生改<WP=5>变而产生了新的基因型。Reyna-lopez-GE等人用AFLP来检测双相真菌在双相转化过程中DNA甲基化的不同。实验表明DNA甲基化在真菌中普遍存在。并且证明了真菌在不同形态形成时发生了不同的DNA甲基化。但国内外尚无人用此方法对镰刀菌进行基因分型。基于此，本实验收集真菌性角膜炎患者的真菌刮片镜检及真菌培养均阳性的标本，分离、培养得到镰刀菌进行AFLP指纹图谱分析。一方面建立镰刀菌的AFLP反应体系，筛选出能产生稳定、清晰DNA带型的引物,对镰刀菌进行基因分型。另一方面试图找出可用于早期诊断真菌性角膜炎的实验室方法，为临床早期选择用药提供实验室依据。方法：从真菌性角膜炎患者病变处分离的镰刀菌共20株，包括茄病镰刀菌14株，串珠镰刀菌6株。将所有菌株分离、纯化、重新鉴定后接种于马铃薯培养液内。振荡培养7天，收集菌丝球，用CTAB法提取其DNA。经EcoRI和 MseI双酶切（37℃，6小时），酶切完成后16℃，连接3小时。然后进行预扩增和选择性扩增。扩增后的产物经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染成像。结果：1. AFLP引物的筛选：在建立AFLP分析技术体系基础上，用20株镰刀菌作材料，对AFLP引物进行筛选。结果发现，在所合成的64对引物中，选择其中多态性较高、带型质量较好的3对引物。其引物分别是E-TC M-CAA，E-TA M-CTT，E-TA M-CAC。2. 数据分析：①相似率分析：各菌株间的相似率为74％-90％，在SM=0.74（74％）的相似性水平上，镰刀菌明显地分为两种。2号菌与3号菌、18号菌与19号菌最相似，相似率<WP=6>为 90％，14号菌与16号菌的相似率为87％，，6号菌与7号菌的相似率为84％，12号菌与13号菌的相似率为81％，4号菌与20号菌的相似率为79％，9号菌与17号菌的相似率为74％。②谱系聚类示意图（树状图）：应用ntsys.exe2.10软件样品聚类最短距离法自动生成谱系聚类示意图。如Fig.4所示。③茄病镰刀菌种内AFLP分型：从树状图上可以看出，14株茄病镰刀菌可分为9型，2号菌与3号菌、14号菌与16号菌、18号菌与19号菌、6号菌与7号菌、12号菌与13号菌、15号菌、8号菌、11号菌、10号菌分别为一型。在SM=0.85（85％）的相似性水平上，14号菌、16号菌、18号菌、19号菌、15号菌可归为