解淀粉芽孢杆菌JK-JS8生物膜形成对其抗松枯梢病的影响

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生防细菌可以通过抑制植物病原菌的生长、诱导植物的系统抗性以及与植物病原菌争夺生态位来发挥其生物防治功能。生物膜是生防细菌占据生态位的重要存在形式,能够帮助其抵御不良环境,同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”。阐明生防细菌生物膜在拮抗病原微生物中的作用是探究其生防机制的重要方面。前期研究发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JK-JS8对引起松枯梢病的松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)具有一定的拮抗作用,且该菌株经过发酵培养后能够产生明显的生物膜结构。但生物膜的形成在菌株JK-JS8拮抗病原菌过程中是否发挥了作用尚未可知。为此,本研究通过Zn胁迫使JK-JS8生物膜形成受到抑制,探究了生物膜消失状态下JK-JS8拮抗松球壳孢菌的能力,并通过多个方面解释了JK-JS8菌株拮抗能力降低与生物膜形成之间的关系。同时,为了能使JK-JS8菌株在林间更好地发挥生防功能,探究了不同培养基和环境条件对该菌株生物膜形成的影响。主要研究结果如下:1.解淀粉芽孢杆菌JK-JS8在不同培养基中形成生物膜的能力不同,筛选出酵母浸出粉胨蔗糖培养基(Yeast Extract Sucrose Peptone Medium,YSP培养基)培养下的生物膜形成状况最优。环境条件对JK-JS8菌株的生物膜形成影响较大,30℃下静置48 h是JK-JS8形成生物膜的最佳条件;过酸性或过碱性的环境都不适宜生物膜的生成,中性条件下(p H=7)最适合该菌株生物膜的形成;除Cu2+外其余四种金属离子均对JK-JS8的生物膜形成有不同程度的抑制作用,其中Zn2+和Mn2+对生物膜的抑制效果最强,Mg2+和K+的抑制效果较弱。2.利用ZnCl2抑制JK-JS8生物膜的形成,检测了生物膜缺失状态下JK-JS8拮抗松球壳孢菌的能力,并通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)对生物膜缺失前后脂肽类物质的变化进行了鉴定,表明Zn胁迫导致生物膜消失后,抑菌脂肽Bacillomycin D产量降低,通过平板拮抗试验验证了Bacillomycin D是拮抗松枯梢病菌的主要抑菌物质之一。3.通过RT-qPCR对ZnCl2处理后的JK-JS8生物膜相关基因转录水平进行检测,结果表明胞外多糖相关基因eps A和信号肽酶合成基因sip W的转录水平未出现明显差异、淀粉样蛋白相关基因tas A、表面活性素合成相关基因srf AA、生物膜形成关键调控基因spo0A和Bacillomycin D合成关键基因bam D基因均有不同程度的下调。通过构建spo0A缺失突变株,表明spo0A基因的缺失会影响JK-JS8生物膜形成和Bacillomycin D合成,降低其拮抗松枯梢病病菌的能力。外源添加Bacillomycin D没有使生物膜性状恢复。由此推测Zn胁迫导致JK-JS8拮抗能力降低的原因可能是Zn胁迫下生物膜形成关键调控基因spo0A的转录水平下调,抑制生物膜形成的同时影响了抑菌脂肽Bacillomycin D的合成。4.运用生物信息技术和原核表达系统对JK-JS8生物膜组成蛋白Tas A进行功能分析,结果表明Tas A蛋白对松枯梢病病菌有一定的抑菌活性,表现为接触性抑制。进一步说明生物膜形成在JK-JS8拮抗病原菌的过程中起着重要的作用。
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