论文部分内容阅读
植物天然的遗传抗性是保护植物免受病毒侵染的最有效方法之一。可就我们目前的知识来说，未见到植物中存在对水稻矮缩病毒（rice dwarf virus，RDV）的天然抗性基因。自从RNA沉默在1994年发现以来，它被认为是一种非常保守的抗病毒机制。在RNA沉默通路上有三种蛋白发挥关键作用: Dicer-like (DCL) nucleases、ARGONAUTE proteins (AGOs)和依赖RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerases，RDRs），其中RDR能将单链RNA变为双链RNA，从而被DCL识别并切割产生目标来源的次级siRNAs，从而发挥更强的抗病毒作用。因此，植物生物技术通过利用RNA沉默原理构建转基因植株以对抗病毒的侵染，常用的方法有转人工miRNAs诱导的基因沉默、转录后水平的基因沉默、病毒诱导的基因沉默、发夹结构诱导的基因沉默、转反义链和正义链诱导的基因沉默。在本博士论文中，进行了基于osa-miRNA528前体表达异源artificial miRNAs（amiRNAs)）效率的研究和利用RNA沉默原理分别构建过表达OsRDR6转基因植株和来源于RDV S103′-端序列的S10IR转基因植株的抗病毒分析研究。1.和其它方式利用RNA沉默原理产生siRNAs的转基因技术相比，amiRNAs具有作用目标的特异性和非传递性等优势，被称为第二代转基因技术。由于目前研究还未发现RDV自身能编码miRNAs，而利用水稻内源的osa-miRNA528前体能成功的表达内源序列的amiRNAs去沉默目标序列和调控内源基因的表达。为了分析能否利用osa-miRNA528前体所形成的二级结构去表达异源设计的amiRNAs，因此本实验选择RDVS9正链序列上的2个21nt片段(amiRNA S9-1174和S9-1192）和S11正链序列上的3个21nt（amiRNA S11-864、S11-868and S11-869）片段，利用重叠延伸PCR方法将设计的amiRNAs序列代替osa-miRNA528前体上的miRNA528序列，实验通过农杆菌介导的水稻愈伤组织转化得到转基因植株。实验利用Northern blot技术分析其表达效率，在人工设计的amiRNAs前体所形成的二级结构和osa-miRNAs的二级结构保持相同位置错配和突起的情况下，5个人工设计的miRNAs（amiRNA S9-1174、S9-1192、S11-864、S11-868和S11-869）其中有4个（amiRNA S9-1174、S9-1192、S11-868和S11-869）得到高效表达，其表达效率分别为90.0%、90.0%、66.7%和77.8%。结合Southern blot技术得到的各个转基因株系的拷贝数，结果表明人工设计的amiRNAs表达水平和拷贝数之间没有明显的相关性。2.根据实验室先前的研究表明，通过转反义链降低OsRDR6表达的转基因植株对水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）和RDV的侵染更加敏感，病毒的积累量增加和病毒来源的siRNAs积累减少。考虑到OsRDR6蛋白在产生病毒来源的次级siRNAs上发挥重要作用，因此本实验期望转OsRDR6的正义链去获得高抗病毒的转基因植株。通过构建过表达OsRDR6载体和农杆菌介导的植株愈伤组织转化，实验利用Westernblot技术鉴定得到5个过表达OsRDR6的转基因株系。通过病毒侵染实验，令人失望的是，和野生型的中华11相比，均没有增加对RDV的抗性。通过检测感病株系，5个转基因株系和野生型的中华11在RDV基因组RNA和来源病毒的siRNAs积累上几乎是相同的。Western blot实验发现RDV侵染后，5个转基因株系的OsRDR6蛋白的表达降低。然而和野生型中华11相比，转基因株系的OsRDR6mRNA水平依然是高水平的，因此我们推测OsRDR6蛋白在植物体内必须和其它配体蛋白相结合才能发挥合成双链RNA的功能。由于植物体内其未知的配体蛋白表达没增加，因此，过表达的OsRDR6蛋白可能作为废物蛋白被快速降解掉，从而失去抗病毒功能。3.为了对抗植物的RNA沉默，病毒进化了RNA沉默抑制子便于病毒在寄主体内的侵染。RDV基因组由12条双链RNA构成，根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的移动速度，从慢到快，依次命名为S1-S12。RDV S10编码的非结构蛋白Pns10去发挥RNA沉默抑制子功能。因此，本实验设想在转基因植株中表达S10序列来源的siRNAs，通过RNA沉默通路降低RDV Pns10的表达，从而产生抗病毒植株。在实验中，通过构建了S10IR载体和农杆菌介导的转化，实验得到表达S10序列来源的siRNAs转基因植株。可病毒侵染实验表明，转基因植株没有增加对病毒的抗性。通过检测感病株系，5个转基因株系和对照水稻在RDV基因组RNA和其来源siRNAs积累上几乎是相同的。由于RDV在入侵植株后，RDV S6、S11和S12所编码的Pns6、Pns11和Pns12三个蛋白形成病毒包含体基质（viral inclusion matrix），是病毒复制的“工厂”。我们推测病毒包含体基质能识别病毒序列所产生的siRNAs，从而阻止siRNAs进入其内，使病毒序列来源的siRNA不能发挥抗病毒作用。