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目的：
在人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells,hucMSCs)修复小鼠急慢性肝脏损伤研究的基础上,探讨hucMSCs来源的囊泡(exosomes)对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的小鼠肝脏纤维化的修复效果及机制。可为临床hucMSCs来源的exosomes(hucMSC-Ex)治疗肝脏纤维化提供实验依据和新思路。
方法：体内研究建立CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型,实验组在损伤6W肝脏定点注射hucMSC-Ex,以注射PBS组为对照。不同时间点收集小鼠血清和肝脏组织,通过化学发光法检测血清中透明质酸(HA)含量,ELISA法检测血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量。通过病理HE染色、免疫组化、RT-PCR和Western blot等技术检测肝脏组织中胶原和TGF-β1/Smad信号通路有关指标的表达变化,综合评价体内实验中hucMSC-Ex对小鼠肝脏纤维化的修复效果及可能机制。体外研究采用人重组TGF-β1诱导人肝细胞系HL7702细胞,再加入hucMSC-Ex作用72小时,观察hucMSC-Ex作用前后细胞形态学变化,通过RT-PCR和Western blot技术检测作用前后上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchyme transition,EMT)相关的基因和蛋白表达的变化。
结果：成功建立CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型,体内血清学和肝组织病理学分析显示hucMSC-Ex移植改善了CCl4诱导的肝脏纤维化损伤。HucMSC-Ex移植降低了1型和3型胶原(collagenⅠ和collagenⅢ)基因的表达,减少了小鼠肝脏中细胞外基质(ECM)的沉积;RT-PCR和Western-blot结果也显示hucMSC-Ex移植到小鼠肝脏后也减低了TGF-β1的表达,进而抑制了TGF-β1/Smad信号通路中Smad2分子的激活;免疫组化结果发现对照组(PBS组)小鼠的肝细胞发生EMT,上皮化指标E-钙粘附蛋白(E-cadherin)阳性细胞百分比明显减少,间质化指标N-钙粘附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)阳性细胞百分比显著增加。HucMSC-Ex移植后小鼠肝组织中E-cadherin阳性细胞百分比显著提高,而N-cadherin和Vimentin阳性细胞百分比显著减低;进一步通过免疫组化和Western-blot技术显示hucMSC-Ex移植组的肝组织中肝星状细胞分泌的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)较PBS组表达含量显著减少。体外研究显示,人类重组TGF-β1因子(2 ng/ml)诱导人肝细胞系HL7702细胞3天,观察到HL7702细胞形态由六边形转变为纺锤形,两极拉长似成纤维细胞,同时RT-PCR和Western-blot检测发现诱导后HL7702细胞中的EMT的间质化指标N-cadherin,Vimentin,Twist表达升高,上皮化指标E-cadherin表达下降。实验组加入hucMSC-Ex作用后,HL7702细胞的纺锤形发生逆转,间质化指标N-cadherin,Vimentin,Twist表达下降而上皮化指标E-cadherin表达显著升高。
结论： HucMSC-Ex通过抑制胶原的生成修复CCl4诱导的小鼠肝脏的纤维化,体外hucMSC-Ex逆转了TGFβ1诱导肝细胞发生的EMT,从而发挥了肝脏保护功能。这为hucMSC-Ex为临床治疗肝纤维化提供了实验依据,开拓了新思路和新方案。