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研究背景:由于机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,即为自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)。目前,绝大多数的自身免疫性疾病无法治愈,随着年龄的增长,各受累器官或系统的功能逐渐下降,直至功能丧失,最终导致患者的死亡。人类遗传学研究已经证明,功能性单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与多种自身免疫性疾病相关。有趣的是,大多数自身免疫性疾病相关的SNP(90%)映射到人类基因组的非编码区域。染色体6q23区在自身免疫性疾病中的作用至关重要,并且是一段非常复杂的非编码基因组区域。这一区域包含多种调控元件并与多种疾病相关联。在染色体6q23区上的一个标志性SNP rs6920220已被证实与类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA),系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE),乳糜泻(Celiac disease,CeD),I型糖尿病(Type I diabetes mellitus,TID)以及炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)相关。该SNP位点rs6920220与该区域内其他8个位点处于强连锁不平衡(LD)(r~2>0.8)(rs6933404,rs62432712,rs2327832,rs928722,rs35926684,rs6927172,rs11757201和rs17264332)。至今,哪一个SNP是直接影响自身免疫性疾病易感性的功能性SNP,其分子机制又如何,是悬而未决的研究热点。大量研究表明,肿瘤坏死因子诱导蛋白3(Tumor necrosis factor,alpha-induced protein 3,TNFAIP3)基因是这一区域中最有可能的自身免疫性疾病的致病基因。这8个SNP位于TNFAIP3基因座位上游约140kb的区域。TNFAIP3基因编码一个同时具有泛素化和去泛素化的蛋白质A20。A20通过其泛素编辑和泛素结合活性来抑制NF-κB信号通路的活性,从而实现强大的抗炎功能,在细胞炎症控制中扮演关键角色,A20被认为是炎症反应的关键抑制因子。除了TNFAIP3,这8个SNP的染色质周围还有γ干扰素受体1(Interferon gamma receptor 1,IFNGR1),少突胶质细胞转录因子3(Oligodendrocyte transcription factor,OLIG3)和白介素20受体A(interleukin-20 receptor A,IL-20RA)等基因,这些基因是否与TNFAIP3一同也参与了对自身免疫的调控,也是有待解决的科学问题。实验方法:本文通过使用生物信息学方法分析8个SNP的潜在生物学功能,利用成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 9,CRISPR/Cas9)技术敲除rs6927172元件,应用并改进转录激活因子样核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术,实现对rs6927172元件的靶向结合,利用染色质构象捕获技术(Chromatin conformation capture followed by qPCR,3C-qPCR)探究rs6927172元件与靶基因间的相互作用。利用凝胶迁移或电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)技术评估rs6927172元件与细胞内转录因子结合情况。最后应用Western Blot和qPCR等技术观察基因的表达情况。实验结果:8个SNP中,rs6927172元件具有潜在的转录因子结合等生物学功能,CRISPR/Cas9介导的rs6927172敲除实验表明,缺失该SNP的细胞系,TNFAIP3和IL-20RA基因表达显著降低。此外,本文通过修改基因组编辑工具酶TALEN的经典合成方案,克隆并表达了一个rs6927172的结合蛋白TALE。通过过表达该无转录活性的TALE蛋白,能够阻断多种转录因子与该SNP的结合,同时降低TNFAIP3和IL-20RA基因表达,进一步证实,该位点是一个功能性SNP位点,能够通过结合多种转录因子,影响靶基因的表达水平。本文还进一步通过3C-qPCR技术发现,该SNP位点调节靶基因表达的分子机制。该SNP能够通过长距离分子调控,与TNFAIP3基因和IL-20RA基因的启动子相互作用。rs6927172元件敲除实验和TALE蛋白阻断实验同时证明,该位点与两个靶基因启动子的相互作用显著减弱。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,成功建立了自身免疫性疾病易感位点敲除细胞系,为深入研究该易感位点的生物功能提供了新的实验条件和基础。以往的研究认为,该组处于强连锁不平衡的8个SNP通过调节TNFAIP3基因的功能或表达来影响自身免疫性疾病的易感性。本研究通过敲除实验鉴定出rs6927172是功能性SNP位点,还发现该组SNP不仅影响TNFAIP3基因的表达,同时还影响IL-20RA的基因表达,不仅提示IL-20RA与自身免疫性疾病易感性的关联。还说明该SNP位点是一个可以调控多个靶基因表达的远距离调控子。TALEN是基因组编辑工具,我们首次改造了该TALEN表达系统,成功的在细胞水平表达了一个只有DNA结合功能,没有DNA切割活性的TALE蛋白质。在细胞中表达TALE蛋白,能够结合在rs6927172元件,阻断其他转录因子的结合,进一步证明该SNP功能区的靶基因包括TNFAIP3和IL-20RA。最后本研究利用3C-qPCR技术,深入阐述了该功能性SNP调节两个靶基因的分子机理。量化了其与两个靶基因启动子相互作用的强度,并进一步证实,敲除该SNP和过表达TALE都能够直接影响该SNP与靶基因启动子的相互作用频率。