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通过酶谱分析和切胶检测,发现黑曲霉A-25发酵液分别产生的三型木聚糖酶(命名为XynⅠ、XynⅡ和XynⅢ)和三型β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶(命名为GluⅠ、GluⅡ、GluⅢ)。XynⅢ与GluⅢ属于同一酶蛋白,即XynⅢ同时具有β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶活性。
通过超滤及两次DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析将XynⅢ纯化至电泳级均一纯,经SDS-PAGE测得XynⅢ分子量为27.9KDa。底物特异性鉴定,XynⅢ能够水解桦木木聚糖、燕麦木聚糖、地衣多糖和大麦β-葡聚糖,对羧甲基纤维素、微晶纤维素以及可溶性淀粉则没有活性,是一种双功能酶。XynⅢ为糖蛋白,糖含量为25.63%。XynⅢ的木聚糖酶和β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶的最适pH均为4.6,最适反应温度为50℃;木聚糖酶在pH3.6-10.6之间稳定,β-(1,3.1,4)-葡聚糖酶在pH2.6-10.6之间稳定;将酶液在20℃-80℃水浴保温1h,两种酶活在50℃的范围以内均非常稳定,木聚糖酶活几乎不变,β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶活也在90%以上,当大于50℃时,两种酶活性均迅速下降。Ca2+,Co2+,Cu2+,Mn2+,Pb2+,K+Hg2+,Zn2+,EDTA对木聚糖酶和β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶的活力均有不同程度的抑制,Fe2+和Mg2+对两酶活均有激活作用。两种酶活性不仅显示了相似的最适pH,pH稳定性,而且显示了相似的最适温度,温度稳定性。另外,金属离子对这两种酶活性的影响也趋于一致。
动力学分析表明,以桦木木聚糖为底物,木聚糖酶的Vmax和Km分别为0.258△A/min/ml和4.54mg/ml;以地衣多糖为底物,β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶的Vmax和Km分别为0.149△A/min/ml和10.02mg/ml。而竞争性动力学分析表明,木聚糖和地衣多糖竞争XynⅢ的同一活性中心。纤维素绑定结合实验证实,XynⅢ具有纤维素结合结构域。
这些结果显示XynⅢ是一种新的双功能酶,其木聚糖酶和β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶活性是由XynⅢ的同一活性位点来完成的。