背景:　　 热疗(hyperthermia, HT)特别是加热范围在39-48℃的温热治疗，因临床实施方便，患者耐受性好，安全性较高，毒副作用低，成功地应用于治疗肿瘤和病毒感染等多种疾病中。近年来有报道热疗单独或者联合应用于一些皮肤疾病的治疗，如皮肤肿瘤、皮肤真菌感染、皮肤人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染等，取得了较好的疗效。有多种方法和技术均可实现加热治疗，常见的比如:CO2(Carbon Dioxide)激光、Er: YAG(Erbium: YAG)激光、Nd: YAG(Neodymium: YAG)激光、红外、电外科手术、射频、超声波、微波、热水、热贴等。　　 近年来，局部的温热治疗被成功的应用于不同型别的HPV感染。但是由于加热方法、控温技术、治疗温度(40-150℃)、治疗方案和疗程的不同其治愈率在41-93.5％不等，患者耐受性也各不相同。我们先前采用随机对照临床实验研究证实，应用恒温非接触式局部加热仪局部44℃加热治疗跖疣，随访三个月时治愈率为53.57％，明显高于空白对照组的11.54％。而且患者对这一温度耐受性好，依从性高，随访6个月未见复发病例。在随后的体外和动物实验中，我们发现温热治疗后靶点局部免疫细胞的数量和功能发生了变化，证实44℃局部热疗可引起热疗靶疣局部干扰素(Interferon, IFN)明显升高，从而起到抗HPV感染的作用;44℃可引起疣体角质形成细胞凋亡，引起皮肤局部朗格汉斯细胞(Langerhans cell，LC)迁移和增强抗原提呈功能，从而辅助建立特异性免疫应答消除HPV病毒。　　 在临床研究中我们还注意到针对多发性疣的治疗，只针对靶疣治疗，随着靶疣的消退，其余未治疗的疣体也随之脱落。结果提示热疗刺激机体产生了特异性免疫应答。本实验我们利用自主研制的远红外局部温热治疗仪作为热源，局部加热尖锐湿疣(Condyloma acuminatum，CA)，采用免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)技术检测温热处理后远隔部位（未治疗疣）局部的免疫细胞数目的变化，探讨温热对远隔部位免疫细胞的影响，为温热治疗多发性尖锐湿疣提供免疫学理论依据。　　 最新有研究提示FOXP3(Forkhead box P3)阳性的Tregs在肿瘤和巨大尖锐湿疣组织中聚集，增强局部免疫抑制，并推测，局部FOXP3+Tregs聚集可能是皮损较大的尖锐湿疣实现免疫逃逸的机制之一。而关于温热治疗中免疫细胞尤其是FOXP3+Tregs的研究尚属空白。此外最新研究表明:在治疗癌症患者时使用热疗和化疗相结合的方法比单一接受化疗效果更好，无瘤期更长。且发现热疗后肿瘤中调节性T细胞(RegulatoryT cells，Tregs)数目降低，提示热疗可能通过作用于Tregs而起到治疗肿瘤的作用。　　 鉴于以上研究结果我们拟回答以下问题:皮肤部位低危型尖锐湿疣的消长与局部FOXP3+ Tregs有何联系?疣体是否能通过聚集FOXP3+ Tregs起到抵抗治疗的作用?温热是否能通过减少疣体局部FOXP3+ Tregs起到免疫调节的作用?本实验采用小样本的前瞻性队列研究初步探讨44℃温热治疗生殖器和肛周低危型HPV感染的尖锐湿疣的临床疗效和安全性;采用多点动态观察治疗过程中非靶点疣体的免疫细胞数量及形态的变化情况;在mRNA水平初步探讨了FOXP3+ Treg细胞相关的细胞因子和信号通路因子。　　 材料与方法:　　 一、实验对象　　 受试者为2010年9月至2012年1月于中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊诊断的尖锐湿疣患者，符合2000年卫生部防疫司制订的CA诊断标准。本人或其监护人知情同意，获得中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准(批号2009 No.22)，并符合赫尔辛基宣言。30例受试者(疣体数目≥5个或者单个直径≥2cm)入组。　　 二、实验材料　　 针对多发、融合和/或疣体直径≥1厘米的疣体，选择距离靶疣2厘米外的疣体（非直接加热的疣体），在利多卡因局部麻醉下，在温热治疗后24-48小时内，于治疗前(t0)、治疗后2周(t1)、6周(t2）、12周(t3)沿基底部切取豆粒大疣体，放入福尔马林液中，石蜡包埋备用。同样方法切取疣体-80℃冰冻保存备用。　　 三、临床治疗方案　　 应用自主研制的温热治疗仪（专利号ZL200720185403.3，中国医科大学），采取非接触式的定点加热，光源为钨卤素灯(90％以上的波长为760-2300nm，波峰为1200hm)，通过红外体温检测仪反馈温度，使其恒定。　　 选取靶疣（较大疣体或解剖部位方便进行照射的疣体）进行局部44℃温热治疗，连续治疗三天，每天一次，每次30分钟。间隔7-10天，再连续治疗两天，每天一次，每次30分钟。此后每隔7-10天进行一次治疗，直至疣体消退。3个月时观察临床疗效。随访期为6个月，观察有无复发。　　 四、导流杂交检测HPV型别　　 采用福建凯普生物技术公司HPV导流杂交分型试剂盒。先用基因组抽提试剂盒提取DNA，再进行PCR扩增，产物杂交，显色记录结果。能被检测到的HPV分型有6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304。　　 五、免疫组化检测相关蛋白的表达　　 石蜡切片4μm，用免疫组化染色技术(SP法)检测CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD68+巨噬细胞、CD57+NK细胞、CD1a+LC、FOXP3+Treg细胞数目。石蜡组织经脱蜡、抗原修复、一抗、二抗、显色并拍照，以微测尺标定目镜方格在40倍物镜下的大小，随机选10个视野，计数方格内呈棕色的阳性细胞数，计算出单位面积内细胞的密度。　　 六、荧光实时定量PCR检测Th1、FOXP3+Treg相关mRNA的表达采用荧光实时定量PCR方法检测TGF-β1、IL-10、IFN-γ mRNA的表达。按Qiagen冰冻组织RNA提取试剂说明书提取总RNA:用Takara.PrimeScript RTregagent Kit Perfect Real Time试剂盒反转录合成cDNA; Takara.SYBR Premis ExTaq试剂盒SYBR.Green法进行荧光实时定量PCR扩增，采用双标准曲线法进行相对定量分析。　　 七、荧光实时定量PCR检测FOXP3相关信号分子mRNA的表达　　 CCL17、CCL22 mRNA在温热条件处理后非靶疣处不同时点表达水平变化。方法同六。　　 八、统计学分析　　 采用SPSS13.0版本软件对资料进行统计学分析。测得结果用x±S表示，组间比较采用ANOVA的Dunnett t检验分析，P＜0.05时认为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1、44℃局部温热治疗尖锐湿疣的临床疗效和HPV型别与治疗反应的相关性　　 共有30个患者参与检测，其中18例感染了HPV-6;12例感染HPV-11。在三个月痊愈的患者中8个为HPV-11，6个为HPV-6;在六个月痊愈的患者中10个为HPV-11，9个为HPV-6，HPV型别与治疗结果没有统计学差异。30个人中有4个人退出治疗，最终有26人完成治疗。在第三个月及第六个月时，治愈率分别为51.85％(14/27)和73.08％(19/26)。采用ITT分析方法，假定失访患者均为治疗失败，在第三个月及第六个月时，治愈率分别为46.67％(14/30)和63.33％(19/30)。受试者对治疗有较好的耐受性，不需麻醉，治疗中未见明显副作用，患者仅感觉轻度的热感，偶有针刺感，无明显的疼痛，无破溃无出血，无瘢痕形成。随访六个月，3人失访，其余未见复发。　　 2、温热治疗后不同时点非靶疣疣体局部免疫细胞的动态变化　　 温热治疗后不同时点CD4+T淋巴细胞的动态变化:温热治疗前t0(69.14±21.68)和治疗后t1(101.96±27.00)、t2(107.33±20.60)时点相比真皮浅层的CD4+T淋巴细胞数量增加，差异具有显著性（t1 vs t0，P＜0.05）、(t2 vs t0，P＜0.01)。　　 温热治疗后不同时点CD8+T淋巴细胞的动态变化:温热治疗前t0(28.42±9.26)和治疗后t1(44.30±20.74)时点相比真皮浅层CD8+T淋巴细胞数量增加，但无统计学差异。t2(60.39±17.41)时点相比t0时点真皮浅层的CD8+T淋巴细胞数量明显增加，差异具有显著性(t2 vs t(0)，P＜0.01)。　　 温热治疗后不同时点CD68+巨噬细胞的动态变化:t2(71.67±18.27)时点相比t0时点真皮浅层的CD68+巨噬细胞数量明显增加，差异具有显著性(t2 vs t0，P＜0.05)。温热治疗后t3(7.87±6.56)时点即疣体基本消失时，CD68+巨噬细胞数量较前明显降低，但与t0相比有统计学差异(t3 vs t0，P＜0.05)。CD1a+LC细胞和CD57+NK细胞的动态变化:治疗后t1、t2时点，细胞数量与t0相比均无统计学差异。　　 3、温热治疗后不同时点，非靶疣局部FOXP3在mRNA水平和蛋白水平的动态变化　　 温热治疗后FOXP3在mRNA水平表达量随着时间递减，其中t2(0.14±0.07)与t0(0.76±0.48)时点与相比，FOXP3在mRNA水平表达量下降，具有统计学差异;温热治疗后t1(25.36±16.91)与治疗前t(0)(14.33±5.88)相比FOXP3蛋白表达增加，温热治疗后t2(9.78±3.21)、t3(2.27±1.10)与t0、t1相比，FOXP3蛋白表达减少。而CD4/FoxP3和CD8/FoxP3在t2、t3时均比t0、t1时高。　　 4、温热治疗尖锐湿疣局部FOXP3+Treg相关的细胞因子和信号通路因子的研究　　 (1)、FOXP3相关细胞因子TGF-β1、IL-10、IFN-γ的mRNA的表达　　 温热治疗后与治疗前相比疣体局部TGF-β1 mRNA表达量未见明显变化;IL-10 mRNA表达量在心时比t0、t1时降低，但是无统计学差异;IFN-γ mRNA表达量在治疗后比治疗前明显升高，t2(9.35±4.15)与t0(1.4±0.84)相比，P＜0.01。　　 (2)、FOXP3相关信号分子mRNA的表达　　 温热治疗后疣体局部CCL-17、CCL-22 mRNA表达量比治疗前升高。CCL-22mRNA表达量在t1时比t0时升高，P＜0.05;CCL-17 mRNA表达量在t2时比t0升高，P＜0.01。　　 5、温热治疗糖尿病和孕期尖锐湿疣的疗效和局部FOXP3+Tregs的研究　　 (1)、44℃温热成功治愈3例糖尿病(3/3)合并尖锐湿疣的患者和3例孕期CA的患者(3/4)，治疗过程温和、患者耐受性好、无需麻醉、无出血、无破溃、治愈后无瘢痕形成。随访六个月无复发。　　 (2)、糖尿病和孕期患者尖锐湿疣中局部浸润的FOXP3+Tregs数量明显高于普通尖锐湿疣局部浸润的FOXP3+Tregs数量(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、温热治疗低危型HPV感染所致的尖锐湿疣，疗效好、安全性高、患者耐受性好、复发率低，尤其对于多发或面积较大的疣体只需治疗一点靶点也可达到完全治愈的效果，甚至对一些免疫异常（糖尿病、孕妇）患者合并的尖锐湿疣治疗有效，为临床治疗尖锐湿疣提供了一种全新的无痛无创治疗手段。　　 2、局部温热后在其未直接加热的部位同样出现了CD4+、CD8+T细胞、CD68+巨噬细胞均增多，LC细胞先增多再减少。说明热疗刺激机体产生了特异免疫应答。这可能为温热治疗后其远离部位疣体同样出现脱落提供理论依据。　　 3、治疗初期，疣体局部FOXP3+ Tregs升高，从而起到免疫逃逸的作用，在治疗初期表现为治疗抵抗;而疣体明显消退时，疣体局部FOXP3+ Tregs明显减少。　　 4、温热处理后非靶疣局部IFN-γmRNA表达升高，TGF-β1、IL-10 mRNA未见明显变化。温热处理后非靶疣局部尖锐湿疣皮损内CCL-17、CCL-22 mRNA表达量比治疗前升高。　　 5、糖尿病和孕期患者尖锐湿疣中局部浸润的FOXP3+Tregs数量明显高于普通尖锐湿疣局部FOXP3+Tregs数量。提示机体的不同免疫状态也影响HPV感染局部的免疫细胞成分。