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手足口病是一种危及全世界儿童健康的急性传染病。在中国,每年至少数百万儿童感染手足口病,并有数百例危重症病例死亡。手足口病可由EV71(肠道病毒71)和CVA16(柯萨奇病毒A16)等病毒感染所致,伴有显著的免疫紊乱,表现为炎症T细胞的异常增殖和分化所导致的异常的炎症因子分泌。Notch信号通路在细胞增殖、分化和凋亡等各种生理、病理状态中发挥着重要的作用。近年来研究发现Notch信号可通过细胞因子非依赖途径调控T淋巴细胞分化。我们希望通过本次研究,阐明Notch信号通路在手足口病发病中的可能机制,为开发手足口病有效预防和治疗策略提供重要理论依据。第一部分Notch配体DLL4在手足口病患儿中表达和临床意义目的:了解Notch信号通路在手足口病发病中的作用。方法:2012年6月~2012年12月苏州大学附属儿童医院感染病房和儿科重症监护病房收住的82例手足口病患儿,设为手足口病组,根据其临床表现和实验室结果分为单纯组和脑炎组,对照组为外科腹股沟斜疝择期手术患儿40例,将其流行病学、临床理化特征、外周血免疫细胞水平和Notch配体水平进行分析比较。结果:1.手足口病组外周血单个核细胞中Notch配体DLL1和DLL4的m RNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),而Jagged1和Jagged2的表达在两组间差异无统计学意义,四种配体在手足口病单纯组和脑炎组之间表达差异均无统计学意义。2.流式细胞技术测定手足口病组外周血中树突状细胞(DCs)表面DLL4表达水平显著高于对照组(P<0.05),健康志愿者外周血DCs表面不表达DLL4。3.手足口病组外周血CD3+细胞、CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞水平显著低于对照组,CD3-CD19+细胞水平显著高于对照组(P<0.05),手足口病单纯组CD3+细胞、CD3+CD4+细胞水平显著高于脑炎组,CD3-CD19+细胞水平显著低于脑炎组(P<0.05),而CD3+CD8+和CD3-CD16+CD56+细胞水平两组差异无统计学意义。4.手足口病组外周血单个核细胞中DLL4的RNA表达水平和CD3+淋巴细胞表达呈负相关(r=-0.23,P=0.00),与CD3+CD8+淋巴细胞表达呈负相关(r=-0.23,P=0.02),与CD3-CD19+淋巴细胞呈正相关(r=0.36,P=0.00),而DLL4表达与CD3+CD4+细胞和CD3-CD16+56+细胞无显著相关。5.手足口病组外周血单个核细胞中DLL4的RNA表达水平与脑脊液中WBC总数呈正相关(r=0.45,P=0.01),与脑脊液总蛋白含量(S-TP)呈正相关(r=0.37,P=0.01)(见图2)。结论:Notch信号通路可能参与手足口病的发病;Notch配体DLL4与外周血CD3+,CD3+CD8+和CD3-CD19+淋巴细胞有较强的相关性,可能通过影响这些免疫细胞的数量和状态从而影响疾病的预后,另DLL4与脑脊液中WBC和总蛋白水平显著相关,可能成为判断手足口病并发脑炎的一个指标第二部分人DLL4+DCs对CD4+T细胞向Th1及Th17分化的调控目的:了解体外炎症环境下DLL4+DCs能否调控CD4+T细胞向Th1及Th17分化。方法:体外采用不同的Toll样受体激动剂刺激从健康志愿者外周血分离获得的PBMCs来模拟体内的炎症环境,测定刺激后树突状细胞(DCs)表达DLL4水平和DCs活化状态。分离纯化健康志愿者外周血DCs经过R848刺激获得DLL4+DCs,与来自不同志愿者的纯化后的CD4+T淋巴细胞以1:10的比例共培养,采用流式细胞技术检测细胞内IFN-a和IL-17等细胞因子表达水平,分析DLL4+DCs对CD4+T淋巴细胞分化的调节作用。结果:1.健康志愿者外周血单个核细胞经过不同Toll受体激动剂Pam3CSK4、LPS和R848刺激24h,均能诱导DCs表达DLL4(18.2%~24.7%)。2.R848刺激显著上调了DCs表面HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86的表达水平;R848可以诱导DCs表达IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-6的m RNA显著增加。3.经过R848刺激的DCs和CD4+T细胞以1:10的比例共培养7天,相对于对照组,观察组诱导辅助T细胞表达包括更多IFN-γ和IL-17,提前加入DLL4+特异性中和抗体能够降低IFN-γ和IL-17的水平。结论:体外采用Toll样受体激动剂可诱导人外周血DCs表达DLL4,并活化DCs。DLL4是人DCs诱导CD4+T细胞向Th1及Th17分化的重要分子。