研究背景：癫痫是一种常见的神经系统疾病,其特点是神经元的异常兴奋和同步化放电。癫痫持续状态(Status epilepticus, SE)时死亡率高达20%。慢性癫痫长期反复发作也可引起不可逆的神经功能损害,导致遗留严重的认知功能损害和行为改变。虽然临床已有多种抗癫痫药物,但对于难治性癫痫的疗效仍然有限,需要进一步寻找新的治疗靶点。5-羟色胺(Serotonin,5-HT)是一种脑内重要的神经递质,与抑制癫痫活动密切相关。5-HT受体在脑内共有超过14种亚型,其中5-HT1A受体与癫痫关系最为密切[2-4]。目前5-HT1A受体在急性和慢性癫痫动物模型中究竟是抑制还是促进癫痫作用仍存在一定的争议。这种截然相反的作用可能和各个癫痫模型的机制不同相关。pilocarpine模型相比KA模型更能全面模拟SE过程中的各种特性和长时间SE发作所带来的严重损害。而杏仁核慢性电点燃模型能较好模拟慢性颞叶癫痫发生、过程,因此采用该两种模型来研究5-HT1A受体在急性和慢性癫痫过程中的作用,能提供更好的科学价值。5-HT1A受体在脑内分布广泛,主要分布在脑干、额叶皮层、边缘系统等区域。目前尚不清楚究竟是哪些部位的5-HT1A受体参与了对SE和癫痫形成的作用。有报道海马富含5-HT1A受体且在癫痫发生发展过程中非常重要。5-HT1A受体在颞叶癫痫患者和慢性动物模型中致痫灶、边缘系统区域密度下降,可能参与了癫痫的发生和发作机制。研究各部位5-HT1A受体在癫痫过程中的动态变化可能有助于明确5-HT1A受体的作用机制。但目前尚无在SE模型和慢性杏仁核模型中干预的研究,因此本研究拟通过皮下和海马局部干预,明确5-HT1A受体对Li-pilocarpine所致SE和杏仁核慢性点燃模型癫痫的作用,观察海马5-HT1A受体是否参与其中,为癫痫的治疗寻求新的靶点。目前对5-HT1A受体表达变化的研究多为针对慢性癫病形成的过程,而对急性SE过程中5-HTlA受体的变化未见有报道。细胞外调节激酶(Extracelluar signal-regulated kinase, ERK)参与MAPK信号转导通路[7]。已知5-HT1A受体激活在正常大鼠中能抑制ERK激活。而ERK通路在SE过程中激活后,能与下游的电压依赖性钾离子通道蛋白Kv4.2结合,抑制Kv4.2在CA1区神经元突触体和细胞膜上表达及超极化电流的形成,表现为促进癫痫形成的作用[8-12]。因此,本研究拟观察海马和脑干5-HT1A受体在Li-pilocarpine模型SE过程中的表达变化及Li-pilocarpine模型中激活5-HT1A受体后对ERK通路活化的作用,分析5-HT1A受体的相关作用机制。第一部分5-HT1A受体对大鼠癫痫持续状态的作用目的：通过皮下和海马局部注射5-HT1A受体激动剂或拮抗剂,观察5-HT1A受体对Li-pilocarpine大鼠癫痫持续状态发作的作用。方法：1.280-300g SD大鼠手术植入颅骨电极,术后休息7-10天,按照体重配对分为7个实验组,分别在pilocarpine注射前1小时给予皮下注射以下试剂：组1：磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg;组2：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg;组3：8-OH-DPAT0.1mg/kg;组4：8-OH-DPAT0.5mg/kg;组5：8-OH-DPAT1.0mg/kg;组6：拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg,组7：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg.2.大鼠给予LiCl3meq/kg,22-24h后给予腹腔注射pilocarpine。记录行为学发作GS潜伏期、GS持续时间,脑电图上首次痫样放电、SE潜伏期及总放电时间。脑电记录从pilocarpine注射前半小时到后2小时为止。3.双侧海马干预大鼠给予手术植入颅骨电和微量注射导管(AP:-3.5mm, L:±2.5mm, V:-2.9mm).术后休息7-10天。体重配对分为8-OH-DPAT组和PBS组,在pilocarpine注射前15min分别给予8-OH-DPAT1μg (1μL)和PBS1μL。其余Li-pilocarpine模型建立和脑电、行为学观察同前。结果：1.腹腔给予激动剂各组癫痫持续状态的发生率和急性死亡率未发现存在显著性差异。2.行为学观察激动剂8-OH-DPAT0.5mg/kg和1.0mg/kg组的GS发作潜伏期显著增高,而GS发作累计持续时间较PBS组显著降低,且1.0mg/kg组作用效果优于0.5mg/kg组。3.激动剂8-OH-DPAT0.5mg/kg和1.0mg/kg组的首次痫样放电和SE起始潜伏期显著增高,总放电时间较PBS组显著降低,且1.0mg/kg组作用效果优于0.5mg/kg组。4.低剂量(0.01mg/kg和0.1mg/kg)8-OH-DPAT对行为学和脑电发作均无抑制作用。5.激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg组的抑制作用能被拮抗剂WAY-100635有效抑制,但单纯注射拮抗剂对发作无影响。6.海马干预中,8-OH-DPAT组GS持续时间较PBS组下降,但对GS和脑电图上放电潜伏期无作用。结论：1.5-HT1A受体激活对Li-pilocarpine模型癫痫持续状态形成和发作有抑制作用。2.皮下注射低剂量激动剂0.01和0.1mg/kg对Li-pilocarpine模型癫痫发作无影响。3.双侧海马内5-HT1A受体激活能抑制Li-pilocarpine模型癫痫持续状态发作的严重程度,但不影响癫痫持续状态形成过程。第二部分5-HT1A受体对杏仁核点燃癫痫形成的作用目的：通过腹腔和海马局部给予5-HT1A受体激动剂或拮抗剂,观察5-HT1A受体对杏仁核点燃过程癫痫形成的作用。方法：1.280-300g SD大鼠给予手术植入基底旁杏仁核电极,术后休息7-10天。大鼠测定初始后放电阈值(ADT)后,每天给予大鼠1次电流刺激,刺激强度为ADT,共刺激16天。记录大鼠发作等级、后放电时程(ADD)等参数。2.皮下给药大鼠按体重配对分为6个实验组,分别在每天电刺激前1小时皮下注射以下试剂：组1：磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg;组2：激动剂8-OH-DPAT O.Olmg/kg;组3:8-OH-DPAT0.1mg/kg;组4:8-OH-DPAT0.5mg/kg;组5：8-OH-DPAT1.0mg/kg;组6：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg.3.海马局部干预大鼠在手术时右侧海马植入微量注射导管(AP:-3.5mm, L:-2.5mm, V:-2.9mm),分为8-OH-DPAT组和PBS组,在每天点燃前15min分别给予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余同前。结果：1.皮下注射激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg和0.5mg/kg组显著延缓杏仁核点燃过程发作等级的增加,1.0mg/kg组同时缩短每天点燃的ADD,而且这种作用能被同时注射拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg抑制。2.激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg组停留在1级的天数长于PBS组,停留在5级的天数短于PBS组。同时,达到2、3、4、5级所需要的刺激数均多于PBS组。0.5mg/kg组存在类似作用趋势,但统计无显著性差异。激动剂1.0mg/kg组比PBS组在部分性阶段(1-3级)停留更长的时间,而在全面性阶段(4-5级)停留时间更短,且该作用能被拮抗剂有效抑制。3.激动剂加拮抗剂组停留在4级的天数长于激动剂1.0mg/kg组,而到达2、3、4、5级的天数明显短于激动剂1.0mg/kg组,其中到达3级和4级的天数两组间存在显著性差异。4.低剂量激动剂0.1和0.01mg/kg组对发作等级和ADD各指标均无影响。5.海马局部干预与PBS组相比对点燃过程发作等级和ADD各指标均无影响。结论1.皮下注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg延缓杏仁核模型点燃进程,对慢性颞叶癫痫形成具有抑制作用,且这种作用在部分性癫痫阶段最明显。2.皮下注射低剂量激动剂0.01和0.1mg/kg对杏仁核模型癫痫形成无影响。3.海马5-HT1A受体不参与对慢性癫痫形成的抑制作用。第三部分癫痫持续状态中5-HT1A受体表达水平的动态变化及ERK通路的研究目的：明确脑干和海马5-HT1A受体在Li-pilocarpine模型SE过程中的表达变化,并观察5-HT1A受体激活后对SE过程中ERK通路活化的作用。方法：1.250-300g SD大鼠建立Li-pilocarpine模型。在pilocarpine给药后0小时,1小时,2小时,6小时和24小时留取海马和脑干的石蜡切片标本和蛋白组织标本,分别用于对5-HT1A受体的免疫组化和Western blot检测。2.经微波修复后,进行免疫组化染色。切片在显微镜下拍照后将图片导入Image-Pro Plus6.0图像分析软件,测算阳性细胞数、阳性面积和平均光密度值。3.通过Western blot方法半定量检测5-HT1A受体在各时间点的表达变化。4.用于ERK通路研究的大鼠根据体重配比分为4组,组1：空白对照组：在给予氯化锂后24小时,给予磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg替代pilocarpine注射；组2：单纯Li-pilocarpine模型组；组3：皮下激动剂干预组：建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小时皮下注射激动剂8-OH-DAPT1.0mg/kg;组4：皮下激动剂合并拮抗剂干预组：建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小时前皮下激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg注射。分别在pilocarpine给药后0小时,1小时,2小时,6小时和24小时留取海马蛋白标本。4.通过Western blot方法半定量检测pERKl/2和ERK1/2在各时间点的表达变化。结果：1.脑干5-HT1A受体主要表达在中缝背核(DRN)和中央上核(MRN),分布在5-HT神经元细胞膜上,少部分在胞浆中可见。5-HT1A受体在pilocarpine注射后1小时表达增加,但进入SE晚期(6小时和24小时)表达减少。其中DRN受体变化的幅度大于MRN。2.海马5-HT1A受体分布在CAl区,CA3区和DG区的锥体细胞和颗粒细胞膜上,但表达浓度不高。海马受体在pilocarpine注射后2小时表达增多,但在SE晚期期(6小时和24小时)表达下降。3. Li-pilocarpine模型组pERK/ERK值显著高于空白对照组。其中以pERK2变化为主,在整个SE过程中持续增高。而pERKl仅在SE晚期升高明显。激动剂使pERKl/ERKl和pERK2/ERK2在SE过程各时间点均较低,而合并拮抗剂组该作用消失。结论：1.脑干中缝核区5-HT1A受体表达在pilocarpine注射后1小时升高,SE后期表达下降。DRN受体密度变化程度大于MRN。2.海马5-HT1A受体在pilocarpine注射后2小时表达增高,后期表达明显减少。5-HT1A受体表达改变与神经元密度变化不完全相关。3.5-HT1A受体激活能有效抑制Li-pilocarpine模型SE过程中的pERKl/2的表达,对ERK通路具有抑制作用。