【摘 要】
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2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）,是糖尿病患者中最主要的患病类型其患病率在全球范围内逐年攀升,危害人类的生命健康。目前,针对T2DM的治疗方式以延缓碳水化合物在肠道中的消化吸收和改善胰岛素抵抗为主,进而调节血糖代谢。但目前以α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）为靶点的抑制剂存在多种不良副作用或生物利用度低下等因素而限制了其在临床的应用。仙草（M
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2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）,是糖尿病患者中最主要的患病类型其患病率在全球范围内逐年攀升,危害人类的生命健康。目前,针对T2DM的治疗方式以延缓碳水化合物在肠道中的消化吸收和改善胰岛素抵抗为主,进而调节血糖代谢。但目前以α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）为靶点的抑制剂存在多种不良副作用或生物利用度低下等因素而限制了其在临床的应用。仙草（Mesona chinensis Benth.,MCB）是我国华南地区重要的经济作物,在民间被作为食药材治疗糖尿病,并具有降血糖血脂作用等重要的生理功能。但是,多数研究集中研究仙草粗提物的生物活性,对于其降血糖活性成分未有鉴定,且具体机制尚不明晰。因此,本文通过对仙草丙酮粗提物进行分部萃取,得到正己烷相（HF）、乙酸乙酯相（EAF）、正丁醇相（BF）和水相（Aq F）提取物,并以抑制肠道碳水化合物消化酶和增强胰岛素敏感性为活性导向筛选活性部位,再利用GC-MS和UHPLC-MS/MS分析鉴定活性部位的主要成分,最后利用抑制动力学、荧光光谱法、热力学性质、同步荧光光谱法、圆二色谱（CD）法和分子对接等方法分析活性部位及其主要成分与相关蛋白的抑制机理和结合方式,以期阐明仙草中具有降血糖的活性成分及其靶向抑制作用机理,为开发仙草降糖功能性食品提供理论依据。本文研究的主要结果如下:（1）采用体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性评价方法,评价仙草不同极性部位降血糖作用。结果表明:EAF具有最高的总多酚（580.23 mg GAE/g,DW）和总黄酮含量（312.63 mg QUE/g,DW）。HF具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50=72.00μg/m L),其次是EAF(IC50=150.33μg/m L),但各相对α-淀粉酶的抑制能力较弱。因此,各相均对α-葡萄糖苷酶具有选择性抑制能力,其中HF和EAF选择指数（Selectivity index,SI）分别为88.37和26.01,大于阳性对照阿卡波糖（0.20）。（2）采用GC-MS和UHPLC-MS/MS技术,对高活性部位HF和EAF进行化学成分分析及鉴定。结果表明:HF中主要成分为α-亚麻酸,其相对含量最高,为10.52%,其次是棕榈酸（8.77%）,二氢猕猴桃内酯（3.20%）,2,6,10,15-四甲基十七烷（2.85%）,亚油酸（2.84%）,2,6,11-三甲基十二烷（2.70%）,4,6-二甲基十二烷（2.54%）和（Z）-/（E）-藁本内酯（2.43%）,八种物质共占总含量的33.85%。EAF中主要成分有迷迭香酸、紫云英苷、异槲皮苷、咖啡酸、原儿茶酸和原儿茶醛,其中迷迭香酸含量最高,为270.22μg/mg。（3）采用抑制动力学、荧光光谱法、CD法和分子对接等分析方法阐明高活性部位HF和EAF对α-葡萄糖苷酶的抑制机理。结果表明:HF和EAF均为可逆性混合型抑制剂,抑制类型介于竞争性与反竞争性之间,但EAF与α-葡萄糖苷酶的结合力更强。HF和EAF均能以静态方式猝灭α-葡萄糖苷酶的内源性荧光;但HF的结合位点数为1,而EAF结合位点数则因温度升高由2降至1。HF的结合过程是疏水作用力主导的熵驱动吸热自发反应;而EAF的结合过程是氢键和范德华力主导的焓驱动放热自发反应。HF和EAF能使α-葡萄糖苷酶的酪氨酸（Try）残基的微环境极性减弱,疏水性增强,但未改变其色氨酸（Trp）残基的微环境。HF和EAF均能不同程度地使α-螺旋结构增多,而β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构减少,从而不利于活性口袋的形成。分子对接显示HF和EAF中的主要成分二氢猕猴桃内酯、亚油酸和紫云英苷和咖啡酸分别以疏水作用和氢键为作用力结合到活性口袋。（4）采用体外抑制PTP1B和T-细胞蛋白酪氨酸磷酸酶（TC-PTP）活性评价仙草不同极性部位改善胰岛素抵抗作用,并对高活性部位中PTP1B抑制剂进行虚拟筛选及体外抑制机理分析。结果表明:HF表现出良好的PTP1B选择性抑制能力(IC50=61.43μg/m L),对TC-PTP抑制能力较弱(IC50=230.90μg/m L)。分子对接显示,根据结合能在HF中虚拟筛选出的（Z）-藁本内酯通过氢键与变构位点结合并形成疏水区域,阻碍催化位点的移动和闭合。体外抑制机理显示,（Z）-藁本内酯对PTP1B的抑制能力(IC50=344.02μM)强于对TC-PTP(IC50=476.66μM),并属于可逆的反竞争性抑制剂,Ki为842.45μM。（Z）-藁本内酯对PTP1B的荧光猝灭过程属于动态猝灭,且仅有一个结合位点。其结合过程是氢键和范德华力主导的放热焓驱动自发反应。（Z）-藁本内酯使PTP1B的α-螺旋结构减少,其余二级结构增多,从而使得蛋白结构松散,不利于活性口袋催化底物。
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