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研究背景与目的:
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重危害人类健康的疾病，也是骨科领域常见的疾病。近年来随着交通和建筑业的发展，SCI的发生率每年都在上升，据统计，迄今为止全世界约有2500万脊髓损伤患者，且每年新增病例超过13万。根据我国2002年的一份调查显示我国脊髓损伤发病率约为60/106，平均住院时间为189天，平均住院费用约为27万元。脊髓损伤的后果严重，轻者丧失劳动能力，重者瘫痪、大小便失禁、丧失生活自理能力，给家庭和社会带来沉重的经济负担。
随着生物医学的发展，干细胞特别是神经干细胞在脊髓损伤领域的研究，给脊髓损伤的治疗带来了新的希望。近年来，越来越多的学者开始关注脊髓内源性神经干细胞在脊髓损伤修复中的作用，内源性神经干细胞在脊髓损伤后的动员调节机制成为一个新的研究热点。
早在十余年前已有研究证实了脊髓内存在能够自我更新和多向分化的祖细胞，也即内源性神经干细胞(Endogenous neural stem cells)。而进一步的实验研究表明脊髓内源性神经干细胞绝大多数存在于室管膜和室管膜下区，并且研究显示脊髓损伤后该区域的内源性神经干细胞会发生类似“激活”现象——快速增殖，并可以向损伤附近区域迁移，分化。进一步研究表明，脊髓损伤后内源性神经干细胞可以发生迁移并逐渐分化为神经系统的三种主要细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，且分化方向并不固定，而是由内源性神经干细胞所处的环境决定的。
甲强龙是目前常用的临床治疗急性脊髓损伤的药物，大剂量甲泼尼龙注射治疗(megadose of methylprednisolone，MP)，已经被美国脊椎损伤协会(AmericanSpinal Injury Association，ASIA)列为SCI后的常规治疗之一。甲强龙可抑制脊髓损伤后各种炎症细胞的激活和增殖，减少各种炎症因子及自由基的产生，从而降低损伤后炎症反应的水平，抑制脂质过氧化作用，减轻继发性损伤，保护神经功能。然而随着脊髓内源性神经干细胞相关研究的深入，有相关研究发现甲强龙在脊髓损伤后的应用不仅可以抑制炎症细胞的激活等一些炎症反应，还会抑制脊髓损伤后内源性神经干细胞的增殖动员，但就这一抑制作用的机制解释尚未达成的共识。
本研究的思路是用甲强龙干预体外培养的NSCs，与正常培养的NSCs对比，观察其对体外培养的NSCs增殖的影响，并进一步用表达谱芯片技术筛选受甲强龙影响表达发生变化的基因，从而进一步研究甲强龙抑制NSCs增殖的可能机制。目前国内外虽然在该方面有研究，但研究较少，尚未达成共识，且本研究中采用小鼠全基因组表达谱芯片，能较为全面的筛选受药物影响的表达发生变化的基因，为下一步分析甲强龙抑制NSCs增殖的机制提供比较全面科学的依据。本研究内容包括三部分：第一部分：小鼠神经干细胞的分离、体外培养和鉴定；第二部分：甲强龙对小鼠神经干细胞体外增殖能力影响的实验研究；第三部分：应用表达谱芯片技术研究甲强龙抑制神经干细胞增殖能力的可能机制。
研究方法:
取孕14.5d胎鼠，显微镜下分离取出胚胎脑组织，剔除脑膜、血管，用DMEM/F12(添加EGF、bFGF、B27和肝素)培养基培养NSCs，细胞培养至第2代，常规进行免疫细胞化学鉴定。用甲强龙干预体外培养的NSCs作为实验组，以正常培养的NSCs为对照，用显微镜观察、细胞计数及CCK-8法在不同的时间点检测细胞增殖状态，判断甲强龙对NSCs增殖能力的影响。绘制细胞增殖曲线并进行统计分析。用甲强龙干预的NSCs和正常培养的NSCs作为实验组和对照组，用Trizol一步法提取细胞总RNA，样本RNA进行荧光标记后，与小鼠全基因组表达谱芯片进行杂交，然后进行芯片扫描，数据处理与分析。了解受甲强龙影响表达发生变化的基因，分析推断其影响NSCs增殖的可能机制。
结果:
1.分离培养的细胞为悬浮呈神经球样生长，经过免疫细胞化学鉴定，Nestin染色阳性；5％胎牛血清诱导分化后，Tuj-1，O4，GFAP染色阳性，可以确定细胞为NSCs。
2.显微镜下观察甲强龙对NSCs增殖能力的影响，可见加强龙组的NSCs增殖速度明显不及对照组，细胞接种后第3～4d即可见明显差别。细胞计数结果同样提示甲强龙干预后细胞增殖受到抑制，统计学分析结果显示实验组和对照组之间有统计学差异。CCK-8法检测结果提示甲强龙可以导致NSCs增殖受抑制，且随着药物浓度的提高，该抑制作用逐渐增强。
3.表达谱芯片检测实验组和对照组RNA样本，共得到的143个表达差异基因。其中110个表达上调基因，明显上调的有12个；33个表达下调基因，明显下调的8个。表达下调的基因中内皮素受体B(endothelin receptors B，EndrB)下调明显，Ratio值为0.363。推断EndrB下调为甲强龙抑制NSCs增殖的可能原因。
结论:
1.体外培养小鼠NSCs的方法简单可行，细胞体外扩增速度快，免疫细胞化学染色荧光信号明显，可以确定细胞为NSCs。
2.细胞计数结果和CCK-8法检测结果提示甲强龙对NSCs的体外增殖有明显的抑制作用，且随着药物浓度增加其抑制程度逐渐增强。
3.表达谱芯片检测结果提示表达发生变化基因共143个，其中EndrB表达下调明显，根据目前一些研究结果推断EndrB下调及其下游的信号通路改变可能是甲强龙抑制NSCs增殖的主要机制之一。