鳜铁调素参与铁平衡和免疫应答

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驯化可以改变鳜(Siniperca chuatsi)的表型和生理特征。在这里,我们从分子水平的变化分析人工饲料饲养的驯化组鳜(DM)和活鱼饲养的对照组鳜(CM)之间的差异。肝脏是一种仅在脊椎动物中发现的器官,在体内具有许多功能,包括储存糖原和铁、解毒功能、合成血浆蛋白和分泌胆汁促进消化和代谢等。在本研究中,RNA-seq用于分析DM和CM的肝脏转录组,使用Trinity对过滤后的数据进行拼接得到191138个contig,将contig组装成136260个transcript,并进一步聚类得到74995个unigene,N50为2187bp。27146(36.20%)和21102(28.14%)unige ne分别注释到NR和Swissprot的数据库中。12528个unigene注释到GO livel2的67个类别中,10422个unigene注释到KEGG livel2的33个通路中,以及25598个unigene注释到egg NOG数据库的25个类别中。通过对转录组数据分析,DM和CM之间有591个差异表达基因,其中395个基因上调,196个基因下调。在DM和CM之间选择显著差异表达的与消化、代谢和免疫相关的20个差异基因,通过qPCR分析验证并用于进一步研究,其中14个基因与消化和代谢过程有关,8个基因表现出上调,6个基因表现出下调。另外6个基因与免疫反应有关并且均表现出上调。对肝脏中差异表达基因和基因调控过程分析,为指导鳜的养殖和驯化提供重要研究材料。同时我们鉴定出34651个单核苷酸多态性(SNP)和29273个微卫星(SSR)。SNP中的C/T(31.29%)和A/G(31.20%)的转换最丰富。SSR中的单核苷酸重复最丰富,占48.70%。SNP和SSR将为调查鳜的种质资源保护和分子标记辅助育种提供宝贵的遗传资源。同时我们分析了肝脏中表达最高的铁调素(hepcidin)基因。hepcidin是一种主要由肝脏产生的一种分泌激素,与机体的铁平衡和炎症反应有关。在本研究中我们分析了鳜铁调素(Sc-hep)基因的分子特征和功能,Sc-hep的ORF为261bp,可编码86个氨基酸,其中前24个为信号肽,中间40个为前肽,最后22个为成熟肽。其氨基酸序列与已报道的鲈形目鱼类相比较保守性最高,其中与大口黑鲈(Micropterus salmoides)(90%)、小口黑鲈(Micropterus dolomieu)(90%)、日本真鲈(Lateolabrax japonicus)(88%)和黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)(84%)的亲缘关系最近。Sc-hep具有特有的8个半胱氨酸的保守序列,其基因结构是由三个外显子和两个内含子组成,在脊椎动物中非常保守。蛋白质结构预测表明Schep成熟肽是β折叠特征,由8个半胱氨酸残基连接形成的4个二硫键稳定。qPCR结果表明Sc-hep广泛分布在各个组织中,但主要在肝脏中表达。并且在ISKNV感染或LPS注射后,Sc-hep的表达在肝、肠、肾、头肾、鳃、胃和脑中均有不同程度的上升;当FS注射后,Sc-hep的表达在肝、肠和肾中表达量升高,而在其他组织中没有显著差异。同时我们分析了肝与其他组织之间Sc-hep的启动子区域(1804bp)的5个Cp G位点,结果表明这5个Cp G位点全部被甲基化,组织之间没有差异。我们还预测到18个micro RNA(mi RNA)与Sc-hep的3’-UTR具有靶向结合位点,最后通过qPCR和双荧光报告系统验证了只有mi R-19c-5p能够抑制Sc-hep的表达。另外,在FS或LPS注射后,我们同时分析了与hepcidin发挥功能机制相关的3个与铁平衡相关基因和5个与免疫相关的细胞因子的差异表达水平,并与Sc-hep的表达进行对比分析。1、肝脏和肠道中铁平衡相关基因的表达在注射PBS、FS或LPS 24小时后,分别在肝和肠中定量Sc-hep与铁平衡相关基因(FPN1、TFR1和FTN)的mRNA水平。以PBS组为对照。FS注射24小时后肝脏和肠中Sc-hep的相对表达量显著增加;FPN1和TFR1的相对表达量在肝和肠中显著降低;肝脏中FTN的相对表达量增加,肠中无显著差异。LPS注射24小时后肝脏和肠中Sc-hep的相对表达量显著增加;FPN1的相对表达量在肝脏中显著增加,肠中无显著差异;TFR1的相对表达量在肝脏中显著降低,肠中无显著差异;FTN的相对表达量在肝脏和肠中没有显著差异。2、头肾中免疫相关基因的表达分析注射PBS、FS或LPS 24小时后头肾中Sc-hep与免疫相关基因(IL-1β、IL8、TLR22、TNF-α和SOCS3)的mRNA水平。以PBS组为对照。对于FS组,Sc-hep、IL-1β和IL8的相对表达显著上调,SOCS3的相对表达显著下调,TLR22和TNF-α无明显差异。对于LPS组,Sc-hep、IL-1β、IL8、TLR22和TNF-α的表达显著上升,而SOCS3的相对表达没有显著差异。结果表明,Sc-hep能够参与铁平衡和免疫应答,为调控鳜的铁代谢平衡和发挥免疫功能保护宿主提供了研究材料。
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