目的：在体外分离培养正常人结膜杯状细胞，通过光镜和透射电镜观察其形态结构，并进行组织学鉴定；观察体外培养杯状细胞的生长特性。观察神经生长因子(NGF，nervegrowthfactor)对体外培养正常人结膜杯状细胞增殖及杯状细胞中MUC5AC基因表达的影响，为临床治疗杯状细胞缺乏及功能下降相关的眼部疾病提供实验室理论依据。 方法：(1)外眼手术中切下的正常球结膜，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中以组织块培养法进行培养。通过光镜下细胞形态、特殊组化染色和免疫组化染色方法进行鉴定。 (2)收集第三代细胞以104个/ml接种于24孔板，每孔加0.5ml细胞悬液。每日取3孔进行细胞计数，共计12天，以测定细胞生长曲线。并计算对数生长期群体细胞倍增时间。 (3)收集第三代细胞，2.5％戊二醛前固定2小时，1％锇酸磷酸缓冲液4℃后固定2小时后，脱水、包埋、切片，于PhilipsEM208s透射电镜下观察及照相。(4)在盖玻片上培养的第三代细胞经100％甲醇固定后，以抗NGF高亲和力受体(TrkA)的单克隆抗体进行免疫组化染色，以初步检测杯状细胞表面是否存在此受体。 (5)通过MTT法观察不同浓度NGF(20，40，60，80ng/ml)对杯状细胞增殖的影响，于加药后第1、3、5天在酶标仪上选择570nm波长，测每孔的吸光度A值，取6孔均值。各组实验重复三次。 (6)收集第三代细胞分两组，一组加入含80ng/mlNGF的RPMI1640培养液，另一组不加NGF作为阴性对照。5天后收集细胞，提取总RNA，反转录后通过PCR方法以MUC5AC引物扩增反转录产物(G3PDH引物作为内参照)，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成相系统照相，并用Bandscan软件测定各组条带的灰度值，MUC5AC目的条带与相同标本的G3PDH灰度值相比，即MUC5ACmRNA表达量。 结果：(1)结膜杯状细胞可在体外成功分离培养，培养后24小时可见细胞从组织块长出，48小时后可见细胞贴壁生长，4～6天后可形成细胞单层，并可传5代。通过酶消化法及机械刮除法去除混杂的上皮细胞及成纤维细胞，传至第3代杯状细胞纯度约可达80±5％。在原代培养中，倒置相差显微镜下可见靠近组织块的细胞体积较小，近周边的细胞体积较大。杯状细胞大部分呈长椭圆形，也可呈翼状、梭形等。传代后细胞多呈长椭圆形。原代和传代培养的杯状细胞中均含有粘蛋白颗粒，均对阿利新蓝/过碘酸—希夫试剂(AB-PAS)染色呈强阳性反应，胞浆着染呈蓝色和紫红色；免疫组织化学染色发现：培养的杯状细胞对杯状细胞的特异标记物cytokeratin-7(CK-7)和MUC5AC单克隆抗体呈阳性反应，而对上皮细胞的特异性标记cytokeratin-13(CK-13)单克隆抗体呈阴性反应。 (2)培养的杯状细胞在传代后第1～2天为潜伏适应期，第3天进入对数生长期，第9天进入平台期，生长曲线呈横S型。对数生长期群体倍增时间约为3.19天。 (3)透射电镜下可见杯状细胞体积较大，呈长椭圆形，核小呈圆形，胞浆中充满白色粘蛋白颗粒，呈圆形，大小不一，有膜包绕。 (4)以抗TrkA单克隆抗体为一抗对培养的杯状细胞进行免疫组化染色显示，呈阳性反应。 (5)加入含不同浓度NGF的培养液后第1天可见，80ng/mlNGF组杯状细胞增殖比对照组明显增强，与对照组比较差异有显著统计学意义；其它组也有促进杯状细胞增殖作用，但与对照组相比差异无统计学意义。第3天60ng/mlNGF组和80ng/mlNGF组杯状细胞增殖比对照组明显增强，差异有显著统计学意义。第5天，40ng/mlNGF组、60ng/mlNGF组和80ng/mlNGF组杯状细胞增殖均明显比对照组增强，差异有显著统计学意义；20ng/mlNGF组杯状细胞增殖也比对照组增强，但差异无统计学意义。 (6)80ng/mlNGF细胞组MUC5ACmRNA表达量明显高于无NGF组；NGF组电泳条带灰度值明显高于培养液中不含NGF的细胞组，各组以内参照扩增出来的电泳条带灰度值无显著差异。 结论：人结膜杯状细胞可在体外成功培养，并保持在体杯状细胞的某些特性，能够合成粘蛋白颗粒及MUC5AC粘蛋白，并表达其特异性标记。培养的杯状细胞的生长曲线呈横S型，传代后3～9天进入对数生长期。培养的人杯状细胞表面存在NGF高亲和力受体。NGF有促进杯状细胞增殖的作用，并随浓度增加和时间的延长其促增殖作用增强。NGF对杯状细胞粘蛋白MUC5AC基因表达有促进作用。