从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE-52、SephacrylS-200及Q-Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白(ΔnifZAv1)制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZAv1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族(Hsp60family)成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶(6-PhosphateGlucoseIsomerase，PGI)及棕色固氮菌细菌铁蛋白(Bacterioferritin，Bfr)。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZAv1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZAv1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZAv1纯度；而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZAv1，但往往会在ΔnifZAv1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来，从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰(Zhao等，2004)。 通过SephacrylS-200柱洗脱峰收集精度的调整及Q-Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90％的ΔnifZAv1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍(Westernblotting)，以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZAv1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白(OPAv1)相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZAv1的α2β2四聚体构成。ΔnifZAv1的Mo含量、EPR信号(g≈4.3，3.65和2.01)和520-660nm附近的圆二色摩尔消光系数(Δε)也都与OPAv1较相似，从而表明ΔnifZAv1含有与OPAv1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZAv1的Fe含量和对底物(C2H2、H+和N2)的还原活性都较低，分别约为OPAv1的74％和46-50％；而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OPAv1。此外，与OPAv1相同的ΔnifZAv1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-taggedΔnifZAv1(Hu等，2004)的信号明显不同。这就表明，ΔnifZAv1与OPAv1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZAv1中P-cluster数目的减少(约一半)。据此推测出与国外提出的His-taggedΔnifZAv1模型不同的ΔnifZAv1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等(1998)对nifZ产物(NifZ)和nifW产物(NifW)可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响；nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZAv1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25％PEG6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体；在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显；PEG6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZAv1制备物的纯度达到90％以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。