柑橘黄龙病或青果病是一种极具破坏性的柑橘病害,严重威胁着全球的柑橘产业。该病害被认为是由一种专生于植物韧皮部组织的细菌引起。目前在柑橘中已发现了其三种菌株类型,即亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter americanus)。其传播途径包括嫁接和柑橘木虱传播(包括亚洲柑橘木虱Diaphorina citri和非洲木虱Trioza erytreae)。由于引起黄龙病的三种韧皮部杆菌至今还未能获得纯化培养,因此其科赫氏假说(Koch’s postulates)还未得到验证,相关方面的研究(如致病机理)也受到很大约束。另一方面,所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都会感染黄龙病,感病后的植株不仅不能治愈,且易感程度高的品种如甜橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡。但某些品种具有一定的耐病性,如柠檬和其他少数近缘品种。然而,具有抗性的品种至今还未发现。因此,针对黄龙病的管理策略主要局限于利用杀虫剂控制木虱、挖除感病植株和培育无菌苗,尚缺乏有效的调控措施。病原菌侵染植物后,可能引起宿主在基因转录水平、蛋白质水平、代谢水平以及显微结构上发生一系列变化。研究柑橘宿主在这些水平上对黄龙病病原菌的应答,将有助于阐明黄龙病的发病机理,从而为提出新型有效的控制措施提供重要依据。因此,本论文通过生理生化、蛋白组学、基因芯片和显微镜等技术研究了柑橘宿主对黄龙病细菌的应答机制,并且全面比较了耐病品种粗柠檬和易感品种甜橙感染黄龙病后在基因表达水平、显微结构方面的变化。主要结果与结论如下:①黄龙病感染甜橙后,淀粉在无症状和有症状的成熟叶中大量积累,与淀粉分解代谢相关的基因DPE2和MEX1被下调表达。在无症状的叶中,叶片和叶中脉的蔗糖和果糖都有显著增加,葡萄糖在叶中脉中水平升高,而麦芽糖含量在叶片和叶中脉中明显降低;在有症状的叶中,蔗糖和葡萄糖水平显著升高,麦芽糖含量降低,果糖含量没有显著变化。这些结果说明,甜橙感染黄龙病后其糖代谢失去平衡,淀粉分解代谢可能受到抑制。此外,细胞壁蔗糖转化酶活性在感病植株的叶中显著升高。结合以上结果,我们推测Ca. L. asiaticus的营养方式属于活体营养型。②利用同位素标记的相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ),成功鉴定了甜橙感染黄龙病后差异表达的蛋白质。结果显示,感病有症状和无症状叶中分别有20和10个差异表达的蛋白质。③几丁质酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和4个miraculin类似蛋白在感病无/有症状甜橙叶片样品中被显著诱导了3.6-13.7倍,这些蛋白主要涉及到胁迫、防御过程,说明感病后甜橙的胁迫应答或防御反应被激活。并且,这些被显著诱导的蛋白质有可能被开发成为黄龙病的诊断标记。④基因芯片结果表明,接种黄龙病细菌后5、17和27周,粗柠檬中差异表达基因的数量分别为684、411和1053;甜橙中分别为391、433和366。受黄龙病显著影响的代谢途径有:光合作用、细胞壁、转录因子、激素代谢、胁迫应答和糖代谢等。⑤光合作用相关基因和MYB-相关转录因子在接种后的粗柠檬和甜橙中都被下调表达。但是,许多代谢途径在两者中受到差异调控。如乙烯信号转导在接种后的甜橙中受到显著调控,而生长素、芸苔类固醇和水杨酸代谢相关基因在接种后的粗柠檬中表达水平发生显著变化;细胞壁相关代谢在粗柠檬中的改变比甜橙更明显。与韧皮部堵塞物质相关的pp2基因只在感病甜橙中被诱导表达,而在粗柠檬中没有显著变化。这些差异应答有助于阐明粗柠檬对黄龙病的耐病性或甜橙的易感性,并为通过基因工程技术提高柑橘对黄龙病的耐受能力提供候选基因。⑥通过光学显微镜和透射电子显微镜技术比较研究了粗柠檬和甜橙感染黄龙病后不同器官的显微结构变化,结果显示,感病后粗柠檬和甜橙有症状叶的显微结构发生了显著改变,如叶中脉韧皮部细胞塌陷、筛管堵塞和淀粉大量累积等。然而,粗柠檬无症状叶受影响程度明显小于甜橙无症状叶;粗柠檬根的显微结构没有明显变化,而甜橙根在发病过程中韧皮部纤维被降解、存贮型淀粉被逐渐消耗。这些显微结构上的差异变化在一定程度上解释了粗柠檬对黄龙病的耐病性和甜橙的易感性。⑦以羧基荧光素(carboxyfluorescein)为标记的韧皮部运载实验表明,感病的粗柠檬其成熟叶片仍能行使接近正常的运输功能,而感病的甜橙叶其韧皮部的运载功能受到了严重抑制。因而,感染黄龙病后的粗柠檬其库器官(如根)仍能得到足够的光合产物,以维持正常的生长;而感病甜橙因韧皮部运输受阻,其新陈代谢必然受到损害,最终导致植株衰亡。