目的探讨小鼠成骨细胞的两种原代培养方法。使用流式细胞仪检测小鼠成骨细胞的周期和凋亡，探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）对小鼠成骨细胞的毒性作用；检测DON毒素对小鼠成骨细胞Runx2基因表达情况的影响；为进一步研究真菌毒素造成骨骼发育不良及畸形的作用机制提供理论依据。方法采用组织块法和胶原酶分段消化法，从乳鼠的顶骨及颅骨中培养原代细胞。采用茜素红、碱性磷酸酶染色法鉴定。用不同浓度的DON（0，100，500，1000ng/ml）分别作用于小鼠成骨细胞24小时。使用PI单染后，采用流式细胞技术检测DON对细胞周期分布的影响；AV-PI双染后，采用流式细胞技术检DON对细胞凋亡的影响。提取细胞总RNA，采用半定量PCR、实时荧光定量PCR技术检测Runx2基因在不同浓度DON毒素的影响下的表达趋势。结果1.原代培养及鉴定两种原代培养方法均能成功获得小鼠成骨细胞。通过组织块培养法得到的原代细胞量少，耗时长，但纯度较高；通过II型胶原酶分段消化法得到的原代细胞数量多，耗时短，但杂细胞较多，需纯化。茜素红、碱性磷酸酶染色结果为阳性，证实所取原代细胞为成骨细胞。2.DON对细胞周期的影响通过流式细胞仪检测的结果显示，在不同浓度DON的影响下，成骨细胞增周期分布出现变化。其中100ng/ml、200ng/ml组与空白对照组相比，细胞周期分布差异不明显，结果无统计学意义。当DON浓度在500ng/ml以上时，与空白对照组的区别显著。500ng/ml DON作用于细胞时，S期细胞的比例开始增多，G2/M期细胞的比例开始减少。1000ng/ml组DON作用于细胞时，S期细胞比例明显增多，G2/M期细胞比例明显减少。细胞出现S期阻滞，可能与DNA合成受到抑制有关。实验证明DON可影响小鼠成骨细胞周期分布，具有明显的抗增殖作用。3.DON对细胞凋亡的影响通过流式细胞仪检测细胞凋亡的结果分析显示，不同浓度的DON毒素作用于小鼠成骨细胞24小时后，随DON浓度的增加，细胞早期凋亡与晚期凋亡均呈现增加的趋势。100ng/ml、200ng/ml组早期凋亡和晚期凋亡与空白对照组相比，差异无统计学意义。500ng/ml组作用于细胞时，UR、LR象限细胞比例上升，凋亡率开始增加。800ng/ml、1000ng/ml组UR、LR象限细胞数明显增多，细胞发生凋亡率增加显著。说明DON可诱导小鼠成骨细胞发生凋亡，凋亡率与使用的DON浓度正相关。4.DON对Runx2基因表达的影响半定量PCR结果显示：凝胶上200-300bp之间出现亮度基本均一的内参条带，300-400bp之间出现亮度逐渐降低的目的条带。在内参条带亮度一致的条件下，目的基因条带的亮度随DON浓度的增加，亮度逐渐降低。说明随着DON的增加，由Runx2转录的mRNA的含量逐渐减少。5.荧光实时定量PCR结果荧光实时定量PCR结果显示：各组内参Ct值基本一致。各实验组Runx2基因表达量与空白对照组的关系为：100ng/ml组约为空白对照组的72.8%，500ng/ml组约为空白对照组的60.9%，1000ng/ml组约为空白对照组的37%。各实验组Runx2基因表达量差异均有统计学意义。结论1. DON抑制小鼠成骨细胞的生长，影响细胞周期的分布，使S期细胞比例增加，G2/M期细胞减少，出现S期阻滞。2.使小鼠成骨细胞发生凋亡，且与浓度呈相关性。具有明显的诱导凋亡和抑制细胞增殖的作用。3.在不同浓度的DON的作用下，小鼠成骨细胞内Runx2基因随着DON浓度的增加，表达量明显降低。