转座子（Transposon element,TE）是存在于生物基因组中的一段DNA序列,能够从染色体上的一个位点转移到另一个位点或者从一条染色体转移到另一条染色体上。转座子广泛存在于原核和真核生物基因组中,是基因组的重要组成部分,在进化中起着重要的作用。长散在核元件（Long interspersed nuclear element,LINE）,属于RNA介导的Class I类反转录转座子,两端不含有长末端重复序列,其对基因组的大小、结构、功能和进化等方面具有重要的作用。桑树是一种落叶性多年生木本植物,除被广泛用于饲养家蚕外,还具有重要的经济、药用和生态价值。随着桑树全基因组测序的完成以及桑树转座子数据库的建成,为研究桑树LINE反转录转座子提供了平台。目前,有关桑树LINE的研究只停留在鉴定分类方面,具体的深入研究则无报道。本研究通过简并引物扩增桑树LINE反转录转座子的反转录酶（Reverse transcriptase,RT）序列,对其特征进行分析,并从全基因组层面对桑树LINE的结构、插入基因区间偏好性和相关基因功能等方面进行分析。最后筛选到由LINE的插入导致选择性剪接发生的基因,对这些基因进行验证,为进一步研究桑树LINE对基因表达调控的影响提供候选基因。研究取得如下主要结果:一、桑树LINE反转录转座子RT片段的特征分析1、使用简并引物从桑树中分离、鉴定得到43条LINE RT序列,对这些序列进行分析,结果显示LINE RT序列核苷酸长度范围在557-595 bp之间,富含AT碱基,AT/GC比例范围为1.26-1.98,其序列间相似度范围为31.8%-99.4%。这些结果表明桑树LINE RT序列具有较高的异质性。进一步对其氨基酸序列进行分析,发现除Mno L₁0之外,都存在终止密码子,并且有93%（40/43）的序列发生了移码突变,说明终止密码子突变和移码突变是导致桑树LINE RT序列异质性的主要原因。2、43个桑树linert序列通过聚类可分为8个组,这个结果与通过相似度分组是一致的,其中仅groupiii和groupviii两组就占克隆总数的72%（31/43）,推测这两组为桑树lines的主要家族。终止密码子分布及多序列比对结果显示,同组中序列终止密码子的分布模式相似,这表明同组lines经历了相似的进化模式,在相同或相近的时期经扩增而来。3、43个桑树linert序列与13个植物物种同源的序列的系统进化分析,显示桑树中的某些rt序列与外源植物的聚在一起,暗示line反转录转座子除发生垂直转移外,在不同物种间还存在着水平转移。4、荧光原位杂交结果显示,桑树lines在染色体上呈散在分布模式,并不是随机分布的,信号主要集中在近端粒区,少部分信号分布在近着丝粒区。二、桑树line的特征分析1、从桑树转座子数据库下载line两个超家族l1和rte的36个全长序列,分析发现其结构中除包含一般line结构中的en、rt、rnaseh元件外,有些家族还包含cchc锌指结构和duf4238,以及嵌套有ltr类型的gag、rt和rnaseh等。2、桑树与其他植物物种同源的linert和en序列的多序列比对结果显示,桑树的linert和en序列与其他物种的同源性较高,都能够找到相应的保守结构域。进一步的系统进化分析显示,无论是基于rt还是en构建的系统进化树,都是l1聚为一支,rte聚为一支,这说明植物lines超家族中的l1和rte在分化后,便朝着不同的方向进行进化。3、通过对桑树中lines插入基因不同区间的偏好性进行分析,发现line主要偏向于插入到基因内部。对这些有line插入的基因进行功能注释和pathway分析,结果显示这些基因主要参与到细胞组分中的cell（37.41%）、organelle（25.37%）和membrane（20.37%）;分子功能中的catalyticactivity（48.35%）和binding（38.07%）;生物功能中的metabolicprocess（23.36%）、cellularprocess（19.97%）和single-organismprocess（17.07%）。pathway分析表明这些基因至少参与到81个生物途径中,这些结果暗示着line反转录转座子可能对参与到多个生物途径中的这些基因具有潜在的调节功能。三、桑树line反转录转座子选择性剪接相关基因的分析1、基于川桑基因位置信息和line反转录转座子位置信息,从桑树基因组中筛选到560个有line插入的基因（称为line相关基因）。进一步结合选择性剪接基因的位置信息,筛选出57个有line插入且发生选择性剪接的基因,保留line插入到内含子-外显子,外显子-内含子,内含子保留或跳过外显子剪接区域的基因。这些由LINE的插入而形成的选择性剪接基因被称为LINE选择性剪接相关基因,共鉴定到10个。2、对10个LINE选择性剪接相关基因的蛋白进行预测,发现Morus009604、Morus023788和Morus026596在桑树全基因组测序结果中因没预测到蛋白类型,被定为假定蛋白。NCBI比对结果显示它们分别与其他物种的多药和毒性化合物外排转运蛋白（MATE）家族ALF5（与白梨的相似度为74%）、节律钟输出基因（GIGANTEA）（与扁桃的相似度为84%）和酰基转移酶（与梅的部分序列相似度为75%）具有较高的相似度。剩余的7个基因在桑树中预测的和其他物种中比对到的结果是一致的,且都具有较高的相似度。3、根据10个LINE选择性剪接相关基因序列设计引物,扩增包含LINE反转录转座子及剪接区域的片段,通过实验对这10个LINE相关基因进行验证。结果表明基因Morus008188、Morus012782、Morus013014、Morus006083和Morus014786的选择性剪接确实是由LINE的插入导致。这五个基因可以作为研究桑树LINE反转录转座子对基因表达调控功能的影响的候选基因。