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研究发现HPVs与人类多种癌发生相关，特别是HPV16、18型，有学者将之称为“高危型”肿瘤病毒。目前，除宫颈癌外，HPVs与喉癌的关系也已受到重视。 多种实验手段研究证实，HPV16／18-DNA可在喉癌组织检出，但是HPV16／18感染在喉癌发生机制中的作用仍未阐明，本文采用非同位素原位杂交和显微图像分析技术，对喉癌组织HPV16／18-DNA杂交信号进行形态学定位和量化，结合免疫组化染色和图像分析测得的增殖细胞核抗原(PCNA)和突变型p53蛋白表达水平，进行相关性分析，讨论HPV感染与喉癌组织的增殖活性和恶性程度的量化关系。 一、材料和方法 收集63例喉癌手术切除石蜡包埋标本，另取声带息肉标本42例作为对照，所有标本均经病理学诊断证实。l）将石蜡包埋标本sw连续切片，每例切取4片，分别作非同位素原位l 杂交、阴性对照、以及p53和 PCNA免疫组化实验。 l、原位杂交：（ISH） 石蜡切片 73℃烤片过夜，脱蜡后，加入 0℃新鲜配制的 IX蛋白酶 K 和DNAjRNA酶稀释缓冲液消化，然后加入HPV16／18生物素核酸探针在 95℃水中变性 10分钟，放入冰水中防止复性 15分钟，之后置入 sthe甲酷 胺湿盒 37℃温箱中杂交过夜，杂交过夜的玻片分次滴加 IX和 ZX封闭蛋白 液5分钟，然后加入生物素抗体及BCIPWBT显色。 2、免疫组化SI方法 切片脱蜡后依次滴加过氧化酶阻断剂、Ich非免疫血清、P53－Ah－2 pCNA－pC10鼠单克隆抗体、生物素标记的第二抗体、链霉素蛋白一过氧化 酶溶液，最后加新鲜配置的DAB溶液显色。 3、所有标本均行显微图像分析 二、结 果 显微镜下 HPV 6／l非同位素原位杂交阳性信号位于细胞核内，为深蓝 色，呈斑块状分布。喉癌组织HPV16／18－DNA杂交阳性率明显高于声带息 肉组织，见表1。经卡方检验，有统计学卜显著性差异（f叫4m，p＜0阴1）。 表IHPV16／18DNA原位杂交阳性率 组织标本 例数 阳性例数 阳性率 喉 癌 63 23 3650O／ 声带息肉42 2 476％ 63例喉癌中，病理分化程度不同的标本阳性率、阳性细胞数和阳性面 2 积见表 2。高分化喉癌组 HPV 6／l－DNA阳性细胞数和面积均高于中低分 化喉癌组（。25750，尸＜0001；u＝25700，尸＜0001）。 表2 HPV16／18－DNA阳性细胞数和面积与喉癌分化程度－，、，，一—＿．．＿HPV阳性 细胞数 面积’分化程度 例数“二二、二’广—— ～‘－’——…一 例数（％）中位数 四分位数 中位数 四分位数 高分化 35 2叮57）2640 00O－9720 050 000－326 中、低分化28 3（107） 000 000－000 00 000－000 HPV16／18－DNA阳性组的PCNA阳性细胞数和阳性面积均明显高于 HPV16／18－DNA阴性组（u＝27300 p＜001；。，25750 p＜00OI），见 表3。 表3 喉癌组织HPV16／8－DNA和PCNA半定量 PCNA阳性细胞数PCNA阳性面积 原位杂交 例数—— 中位数 四分位数 中位数 四分位数 HP＼’阳性23 9320 2320－12200 330 067－504 HPV阴性 4O 3 760 000－7570 098 00－2．81 HP＼’阳性组的p53阳性细胞数和阳性面积均高于WhV16／18－DNA阴性 组…，2门m 厂＜0m1；I，刀05o p＜0皿1），见表4。 3 表4 喉癌组织HPV16／18－DNA和p53半定量 p53阳性细胞数p53阳性面积 原位杂交 例数—— 中位数 四分位数 中位数 四分位数 HPV阳性 23 126．80 0．00－168．00 3．82 0．0－5．75 HI，V阴性 40 15．20 0．00－65．40 0．37 0．o