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研究发现HPVs与人类多种癌发生相关,特别是HPV16、18型,有学者将之称为“高危型”肿瘤病毒。目前,除宫颈癌外,HPVs与喉癌的关系也已受到重视。 多种实验手段研究证实,HPV16/18-DNA可在喉癌组织检出,但是HPV16/18感染在喉癌发生机制中的作用仍未阐明,本文采用非同位素原位杂交和显微图像分析技术,对喉癌组织HPV16/18-DNA杂交信号进行形态学定位和量化,结合免疫组化染色和图像分析测得的增殖细胞核抗原(PCNA)和突变型p53蛋白表达水平,进行相关性分析,讨论HPV感染与喉癌组织的增殖活性和恶性程度的量化关系。 一、材料和方法 收集63例喉癌手术切除石蜡包埋标本,另取声带息肉标本42例作为对照,所有标本均经病理学诊断证实。l)将石蜡包埋标本sw连续切片,每例切取4片,分别作非同位素原位l 杂交、阴性对照、以及p53和 PCNA免疫组化实验。 l、原位杂交:(ISH) 石蜡切片 73℃烤片过夜,脱蜡后,加入 0℃新鲜配制的 IX蛋白酶 K 和DNAjRNA酶稀释缓冲液消化,然后加入HPV16/18生物素核酸探针在 95℃水中变性 10分钟,放入冰水中防止复性 15分钟,之后置入 sthe甲酷 胺湿盒 37℃温箱中杂交过夜,杂交过夜的玻片分次滴加 IX和 ZX封闭蛋白 液5分钟,然后加入生物素抗体及BCIPWBT显色。 2、免疫组化SI方法 切片脱蜡后依次滴加过氧化酶阻断剂、Ich非免疫血清、P53-Ah-2 pCNA-pC10鼠单克隆抗体、生物素标记的第二抗体、链霉素蛋白一过氧化 酶溶液,最后加新鲜配置的DAB溶液显色。 3、所有标本均行显微图像分析 二、结 果 显微镜下 HPV 6/l非同位素原位杂交阳性信号位于细胞核内,为深蓝 色,呈斑块状分布。喉癌组织HPV16/18-DNA杂交阳性率明显高于声带息 肉组织,见表1。经卡方检验,有统计学卜显著性差异(f叫4m,p<0阴1)。 表IHPV16/18DNA原位杂交阳性率 组织标本 例数 阳性例数 阳性率 喉 癌 63 23 3650O/ 声带息肉42 2 476% 63例喉癌中,病理分化程度不同的标本阳性率、阳性细胞数和阳性面 2 积见表 2。高分化喉癌组 HPV 6/l-DNA阳性细胞数和面积均高于中低分 化喉癌组(。25750,尸<0001;u=25700,尸<0001)。 表2 HPV16/18-DNA阳性细胞数和面积与喉癌分化程度-,、,,一—_.._HPV阳性 细胞数 面积’分化程度 例数“二二、二’广—— ~‘-’——…一 例数(%)中位数 四分位数 中位数 四分位数 高分化 35 2叮57)2640 00O-9720 050 000-326 中、低分化28 3(107) 000 000-000 00 000-000 HPV16/18-DNA阳性组的PCNA阳性细胞数和阳性面积均明显高于 HPV16/18-DNA阴性组(u=27300 p<001;。,25750 p<00OI),见 表3。 表3 喉癌组织HPV16/8-DNA和PCNA半定量 PCNA阳性细胞数PCNA阳性面积 原位杂交 例数—— 中位数 四分位数 中位数 四分位数 HP\’阳性23 9320 2320-12200 330 067-504 HPV阴性 4O 3 760 000-7570 098 00-2.81 HP\’阳性组的p53阳性细胞数和阳性面积均高于WhV16/18-DNA阴性 组…,2门m 厂<0m1;I,刀05o p<0皿1),见表4。 3 表4 喉癌组织HPV16/18-DNA和p53半定量 p53阳性细胞数p53阳性面积 原位杂交 例数—— 中位数 四分位数 中位数 四分位数 HPV阳性 23 126.80 0.00-168.00 3.82 0.0-5.75 HI,V阴性 40 15.20 0.00-65.40 0.37 0.o