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对雌性动物而言,每一个繁殖周期都会有无数的卵泡生长,但99%以上的卵泡在排卵前都会发生闭锁,而卵泡闭锁的本质就是卵巢颗粒细胞的凋亡。因此研究卵泡颗粒细胞的凋亡,对提高雌性动物的繁殖性能、延长雌性动物的生育期具有重要的理论意义。miRNA是一类长度为19-25bp的单链非编码RNA,近年来研究发现miRNA在动物卵泡颗粒细胞增殖、凋亡以及分化等过程都起着重要的作用,但关于猪卵泡颗粒细胞凋亡的miRNA调控机制研究较少。本实验室在分析猪卵泡闭锁过程中miRNA表达谱时发现miR-1275在猪卵泡闭锁过程中表达极显著上调。为了进一步研究miR-1275在卵泡闭锁过程中的作用和调控机制,本研究以猪卵泡颗粒细胞为研究对象,分析其在猪卵泡颗粒细胞凋亡和雌激素合成中的作用。研究结果对揭示miR-1275在猪卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁中的作用,阐明猪卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的分子机制均具有重要的意义。本文的主要研究结果如下：1. miRNAs表达谱芯片分析发现miR-1275在猪卵泡闭锁过程中表达极显著上调(P<0.01),说明miR-1275可能参与了猪卵泡闭锁的调控。流式细胞技术分析发现转染miR-1275 mimics后猪卵泡颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P<0.01)。放射免疫测定技术分析发现转染miR-1275 mimics后猪卵泡颗粒细胞中雌二醇含量显著降低(P<0.05), Real-time PCR和Western Blot检测发现转染miR-1275 mimics后猪卵泡颗粒细胞中雌激素生成通路关键酶CYP19A1基因mRNA和蛋白表达水平极显著下调(P<0.01), CYP11A1基因mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。研究结果表明miR-1275可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁,抑制CYP19A1和CYP11A1基因转录以及雌激素生成。2.生物信息学发现CYP19A1和CYP11A1不是miR-1275的靶基因,NR5A2是miR-1275的候选靶基因。构建NR5A2-3’UTR荧光素酶报告载体,然后与miR-1275 mimics共转293细胞,荧光素酶活性分析发现报告基因的活性极显著下降(P<0.01),说明NR5A2是miR-1275的一个靶基因。Real-time PCR和Western Blot检测发现转染miR-1275mimics后,猪卵泡颗粒细胞中NR5A2基因1mRNA和蛋白的表达量极显著下降(P<0.01)。NR5A2超表达后猪卵泡颗粒细胞凋亡率显著下降(P<0.05),而雌二醇含量则显著上升(P<0.05),说明NR5A2可促进猪卵泡颗粒细胞中雌激素生成,抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡。研究结果表明在猪卵泡颗粒细胞中,NR5A2是miR-1275的一个靶基因,miR-1275主要通过与NR5A2基因mRNA的3’UTR相结合,降解NR5A2基因mRNA,抑制雌激素生成,从而促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。3. Real-time PCR和Western blot检测发现NR5A2超表达后猪卵泡颗粒细胞中CYP19A1基因mRNA和蛋白表达水平极显著上调(P<0.01), CYP11A1基因mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。构建猪CYP19A1、CYP11A1基因启动子区荧光素酶报告载体,分别与NR5A2超表达载体共转猪卵泡颗粒细胞,荧光素酶活性分析发现CYP19A1、CYP11A1基因启动子区活性极显著升高(P<0.01)。研究结果表明NR5A2可通过调控CYP19A1、CYP11A1基因启动子区活性来调控其在猪卵泡颗粒细胞中的表达。