代谢综合征(metabolic syndrome，MS)包括肥胖、血脂代谢异常、高血糖或胰岛素抵抗、高血压等相关临床表型，是近年来国内外医学界关注的热点。其主要病理生理机制涉及腹型肥胖和胰岛素抵抗(insulin resistance IR)。目前流行病学和临床研究已经在不同国家、不同种族人群中证实了低出生体重(low birth weight LBW)或宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation IUGR)与成人MS之间的相关性。研究者一直试图解释宫内生长迟缓与成人疾病相关性之间的机制，先后提出冠心病、糖尿病等成人疾病的“胎儿起源”假说(fetal origins of adult diseases)、“营养程序化(nutritional programming)”和“代谢程序化(metabolic programming)”的概念，认为生后早期对不利营养环境的适应可导致胰岛内分泌功能和结构的改变及靶器官的敏感性下降，并可持续至成年期，使2型糖尿病易患性增加。各种动物实验和临床研究也在不断地探索宫内或生后早期营养不良导致以后发生MS的机制。研究发现IR和／或β细胞分泌缺陷参与了宫内生长迟缓者发生MS的病理过程。既往研究所用的动物模型多数是通过限制孕中期或孕晚期营养构建，或者在断乳后再进行生后的营养干预，不能充分反应现在的饮食结构特点和低出生体重发生的原因。胎儿胰岛β细胞发育早期对母体营养状态尤其敏感，在代谢程序化和胰岛β细胞发育可塑性的基础上，宫内全程营养不良和生后立即干预的对低出生体重发展为T2DM的进程的影响尚缺乏研究。经典的胰岛内分泌细胞包括α细胞、β细胞、δ细胞及PP细胞，分别产生胰升糖素、胰岛素、生长抑素及胰多肽(PP)。1999年发现的ghrelin是由28个氨基酸组成的多肽，广泛分布于多种组织或器官中。2002年，Wierup等首次提出胰岛ghrelin表达细胞可能是一种新的胰岛细胞类型。对不同发育阶段的大鼠胰腺组织进行观察发现，胰腺组织中ghrelin阳性细胞的出现明显早于胃组织，并且其数量在胚胎期和出生后的发育过程中呈现动态变化，在胚胎中期至出生后5天的胰岛内达到高峰，之后逐渐减少；ghrelin细胞在胰岛发育过程中表现为一个独立的细胞群体。Ghrelin受体(growth hormone secretagogue receptor GHS-R)可在大鼠和小鼠胰岛β细胞或其细胞株上表达，也在大鼠胰岛α细胞上表达，提示胰岛分泌的ghrelin能通过旁分泌或内分泌的方式对其他类型胰岛细胞发挥调节作用。在Nkx2.2或Pax4基因敲除的小鼠模型中，发育胰岛中产生胰岛素的β细胞被ghrelin表达细胞取代，ghrelin表达细胞的增长是以牺牲β细胞为代价的。Ghrelin可能参与胰腺的发育、增殖和分化。由于ghrelin与发育关键阶段的胰岛素分泌、β细胞发育以及T2DM发生密切相关，我们推测，胰岛ghrelin表达可能是联系低出生体重和T2DM易感性的关键因素之一。早期营养改变时，ghrelin在胰岛上表达趋势如何，与胰岛素的变化有无相关性以及营养干预是否能改变ghrelin在胰岛上表达等将是我们需探索的问题。基于上述研究背景我们希望了解：1．胰岛上ghrelin表达细胞的分布与α细胞、β细胞之间的关系。2．在宫内营养不良时，胰岛ghrelin的表达和ghrelin细胞的分布是否会改变?β细胞的减少是否伴随ghrelin表达细胞数量的变化?3．生后不同的饮食干预是否会改变胰岛ghrelin的表达规律?ghrelin是否在宫内生长迟缓所致的胰岛素抵抗进程中发挥作用?第一部分宫内生长迟缓对新生大鼠ghrelin和胰岛素表达的影响一．目的1．建立宫内营养不良新生大鼠模型，比较分娩后母鼠以及出生后仔鼠血糖、胰岛素和ghrelin水平；2．比较不同营养状态新生大鼠胰岛ghrelin和胰岛素mRNA、蛋白的表达水平；探讨ghrelin主要由何种胰岛细胞表达。二．方法1．宫内营养不良大鼠模型的建立和分组12周龄怀孕第2天的SD孕鼠20只，随机分配入自由进食组(nourished rats；NR)和营养限制组(undernourished rats，UR)。怀孕第2天至23d(分娩时)NR组予标准孕鼠饲料喂养，UR组仅予50％NR组日进食量。NR组母鼠所生仔鼠为正常出生体重组(normal birth weight group NBW，n=79)；UR组母鼠所生仔鼠为低出生体重组(low birth weight group LBW n=74)．2．实验指标检测留取分娩后母鼠和出生后2h内新生仔鼠的血标本；收集新生仔鼠的胰腺标本，取部分冻存于液氮中用于RT-PCR，部分用4％多聚甲醛固定用于免疫组化及激光共聚焦分析，部分用胶原酶消化后行胰岛ghrelin和胰岛素分泌量测定。测定血糖，ghrelin和胰岛素水平测定采用放射免疫法。胰腺ghrelin抽提参照Toshinai et al的方法加以改良。采用完整胰腺静止消化法以分离胰岛，DTZ染色后在显微镜下手工挑选胰岛，在葡萄糖浓度为16.7mmol／L的条件下孵育90 min，随后收集培养液，并测定其中胰岛素含量。采用RT-PCR检测ghrelin和胰岛素mRNA水平的表达。采用免疫荧光双染、DAPI染色和共聚焦显微镜技术检测胰岛ghrelin和胰岛素阳性细胞数。(三)统计学方法应用SPSS统计软件(10.0)进行数据统计分析。资料分别用均数和95％可信区间(95％confidence intervals 95％CI)或中位数表示，两组间差异应用双侧t检验，p＜0.05认为差异有显著性意义。三．结果1．宫内营养不良对血浆ghrelin和胰岛素浓度的影响分娩后，NR组和UR组母鼠的平均体重(95％CI)分别是287(265-326)g和234(198-267)g，NBW组新生鼠的出生体重为5.81±0.64g，LBW组新生鼠的出生体重是4.76±0.23g。每只母鼠所产仔鼠数的中位数(范围)分别是7(5-13)只，其平均仔鼠数不受营养状态的影响。UR组母鼠和LBW组新生鼠的体重均显著低于相应对照组(p＜0.001)。分娩后UR组母鼠ghrelin浓度为1382(1287-1513)pg／ml，明显高于NR组[1072(974-1205)pg／ml](p＜0.001)。生后第一天LBW组和NBW组新生鼠的ghrelin浓度分别为2176(2031-2384)pg／ml和2493(2311-2675)pg／ml，两组间差异有显著性(p＜0.05)。两组新生鼠的ghrelin浓度均比其相应母鼠组高2-3倍。LBW组新生鼠和UR组母鼠的胰岛素浓度也低于相应对照组(p＜0.001)。营养状态也影响到新生鼠和母鼠的血糖浓度，LBW组新生鼠和UR组母鼠的血糖浓度也低于相应对照组(p＜0.001)。2．宫内营养不良对新生仔鼠胰腺ghrelin和胰岛素表达的影响RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)结果显示；LBW组和NBW组胰腺均有ghrelin和胰岛素mRNA表达。LBW组和NBW组ghrelin／β-actin分别是372％(307-513％)和124％(57-198％)，LBW组ghrelinmRNA水平明显高于NBW组。LBW组ghrelin含量为714(632-759)ng／g，也高于NBW组[479(381-732)ng／g](p＜0.01)。LBW组和NBW组胰岛素／β-actin别是112％(67-194％和183％(157-302％)，LBW组胰岛素mRNA水平低于NBW组。高糖(16.7mmol／L，90min)刺激后LBW组的胰岛素含量是782.1(522-986)pmol／islet-90min，NBW组的胰岛素含量是2448.9(1987-2954)pmol／islet-90min，NBW组胰岛分泌胰岛素的能力显著高于LBW组(p=0.007)。3．胰岛ghrelin的表达和分布对两组胰腺进行免疫荧光双染和DAPI衬染显示：NBW组胰岛中央β细胞有较多的胰岛素阳性(insulin~+)细胞，多数ghrelin免疫反应性细胞分布在胰岛周边，把两种荧光结果叠加后与单通道荧光所显示的结果一致。LBW组胰岛中显示多数insulin~+细胞分布在胰岛中央，而且ghrelin阳性细胞也位于胰岛中央，把两种荧光效果叠加可以发现胰岛中央很多细胞为胰岛素和ghrelin共表达细胞。LBW组ghrelin阳性细胞有中央分布的倾向。LBW组ghrelin~+ insulin~+细胞数占整个胰岛细胞的33.7％(95％CI：16.2％-41.1％)。为进一步明确ghrelin表达部位和细胞类型，对两组胰腺又进行了ghrelin和胰高血糖素(glucagon)免疫荧光双染：NBW组glucagon~+细胞分布于胰岛周边，ghrelin~+细胞也分布于胰岛周边，很多细胞同时表达胰高血糖素和ghrelin。NBW组胰岛ghrelin~+ glucagon~+细胞的百分率是5.3％(95％CI：3.9％-9.7％)。在ghrelin和胰高血糖素免疫荧光双染LBW组胰腺切片上，可发现两种独立的细胞群：glucagon~+细胞位于胰岛周边部，ghrelin~+在胰岛中央，切片上没有共表达ghrelin和胰高血糖素的glucagon~+ ghrelin~+细胞。LBW组insulin~+细胞比例为83.1％(95％CI：76.2％-90.1％)，NBW组insulin~+胞的比例为90.1％(95％CI：85.7％-95.1％)，两组间差异有显著性(p＜0.01)。LBW组ghrelin~+细胞比例[48.7％(95％CI：33.2％-56.7％)]显著高于NBW组[15.3％(95％CI：7.2％-20.1％)](p＜0.01)。四．结论1宫内营养不良不仅影响仔鼠出生体重，还影响其血浆ghrelin和胰岛素水平。2 IUGR新生大鼠存在胰岛ghrelin表达和ghrelin阳性细胞分布的改变。第二部分生后营养对宫内生长迟缓大鼠胰岛素和ghrelin表达的影响一．目的1．分析生长发育过程中宫内生长迟缓新生大鼠胰腺胰岛素和ghrelin的表达变化；2．探讨饮食干预对LBW大鼠发生T2DM的病理生理进程影响，了解ghrelin是否在该病理进程中起作用。二．方法1．动物模型的建立和分组宫内生长迟缓的LBW大鼠模型建立同前，出生后仔鼠分组如下：1 NBW-常规饲料组(N-N-组) 2 NBW-高脂高热量饲料组(N-H-组)3 NBW-高蛋白饲料组(N-P-组)4 LBW-常规饲料组(L-N-组) 5 LBW高脂高热量饲料组(L-H-组)6 LBW高蛋白饲料组(L-P-组)2．标本收集以上各组大鼠分别在3天、7天、10天、2周、3周、4周、8周、12周收集血浆标本(n=10／组)，1-3周仔鼠胰腺标本的处理方法参照第一部，4、8和12周大鼠胰腺采用改良静止消化法获取胰岛用于RT-PCR(n=10／组)、ghrelin含量测定(n=10／组)、胰岛素分泌量测定(n=10／组)、胰腺免疫组化(n=5／组)。其他方法和检测指标同第一部分。3．统计学方法应用SPSS统计软件(10.0)进行数据统计分析。各组数据以均数±标准差表示，多组间的比较采用One-way ANOVA检验，p＜0.05差异有显著性。三．结果1各组仔鼠不同时间点的体重LBW组仔鼠在1天-2周各时间点的体重均低于同饲料的相应的NBW组，其差异有显著性(p＜0.05)，LBW组大鼠在1天-2周期间并无“追赶生长”现象。随后LBW组与NBW组之间的体重差异缩小。在12周龄的N-H组和N-P组大鼠的体重明显高于N-N组(p＜0.05)。不同饲料喂养的各LBW组大鼠同一时间点的体重无明显差异。2血糖变化N-H组血糖从第4W起显著高于N-N组(p＜0.05)；L-H组血糖在第2W就高于L-N组，而且随后各时间两组的血糖差异均有显著性(p＜0.05)。L-N组在12W时的血糖也高于N-N组，其差异有显著性。虽然N-P组在12W时血糖升高，但L-P组血糖升高不明显。3各组血胰岛素水平和胰岛素抵抗指数变化生后1d、3d和7d，LBW组的血胰岛素水平均低于NBW组，其差异有显著性(p＜0.05)．在10d至8周，各组大鼠血胰岛素水平逐渐接近，虽然N-P组、N-H组和L-H组大鼠血胰岛素水平略高，但差异无显著性。而L-H组和N-H组大鼠在12W血胰岛素水平均显著升高，与相应常规饲料组相比，差异有显著性意义(p＜0.05)。进一步采用自我平衡模型分析法中的胰岛素抵抗指数(Homeostasis modelassessment-insulin resistance index HOMA-IR)来评价基础状态的胰岛素抵抗指数发现，与NBW组相比，出生后1d、3d和7d，LBW各组的胰岛素抵抗指数明显低于同饲料相应时间点的NBW组(p＜0.05)。随着高脂饲料干预时间的延长，L-H组和N-H组大鼠的HOMA-IR呈现逐渐上升的趋势；在第12W时，L-N组和L-H组的HOMA-IR分别高于N-N组和N-H组(p＜0.05)，而L-P组的HOMA-IR明显低于N-P组(p＜0.05)。与生后1d的IR相比，除N-N组外，N-H组和N-P组以及所有LBW亚组的HOMA-IR均显著升高(p＜0.05)。4各组血浆ghrelin浓度血浆ghrelin水平随各组大鼠日龄的增长呈现下降趋势。在1d、3d和7d，LBW组血浆ghrelin水平均低于NBW组，差异有显著性(p＜0.05)。但在4W、8W和12W，LBW组血浆ghrelin水平略高于NBW组，其差异无显著性(p＞0.05)。5 LBW组和NBW组大鼠胰岛分泌功能的比较虽然各日龄LBW组大鼠胰腺胰岛素分泌水平均低于NBW组，但只有L-H组和N-H组之间的胰岛素分泌水平差异均有显著性意义(p＜0.05)。NBW组内，4W、8W和12W时N-H组和N-P组大鼠胰岛素分泌能力低于N-N组(p＜0.05)；LBW组内，L-H组胰岛素分泌能力低于L-N组(p＜0.05)，但血L-P组在8W和12W的胰岛素分泌水平高于L-N组(p＜0.05)。6 LBW组和NBW组大鼠胰腺ghrelin含量比较LBW组和NBW组胰腺ghrelin含量均随着日龄增长出现下降趋势。各日龄LBW组大鼠胰腺ghrelin含量均高于NBW组(p＜0.05)。NBW组内，2W后N-H组和N-P组胰腺ghrelin含量下降较N-N组明显，两组ghrelin含量下降的幅度与N-N组相比差异有显著性(p＜0.05)；LBW组内，8W和12W时L-H组胰腺ghrelin含量低于L-N组；L-P组胰腺ghrelin含量高于L-N组，但差异均无显著性(p＞0.05)。7 LBW组和NBW组胰腺胰岛素mRNA水平的表达各日龄LBW组大鼠胰腺胰岛素mRNA表达量均低于NBW组。NBW组内，各组间各时间点胰岛素mRNA表达无明显差异。LBW组内，8W和12W时L-H组胰岛素mRNA表达量低于L-N组(p＜0.05)；血L-P组在12W的胰岛素mRNA表达略高于L-N组，但差异无显著性意义(p＞0.05)。8 LBW组和NBW组胰腺ghrelin mRNA水平的表达LBW组和NBW组胰腺ghrelin mRNA水平均随着日龄增长出现下降趋势。1d、3d和7d，LBW组大鼠胰腺ghrelin mRNA表达均高于NBW组(p＜0.05)。NBW组内，各日龄N-H组和N-P组胰腺ghrelin mRNA表达与N-N组相比差异无显著性；LBW组内，4W、8W和12W时L-P组胰腺ghrelin mRNA表达高于L-N组，L-H组胰腺ghrelin mRNA表达略低于L-N组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。9 LBW组和NBW组胰岛insulin~+细胞和ghrelin~+细胞数变化的比较LBW组和NBW组胰岛胰岛素~+细胞比例均随着日龄增长出现下降趋势。LBW组各时间点insulin~+细胞百分比均略低于相同饲料的NBW组，但两饲料相同组各时间点的insulin~+细胞百分比差异无显著性意义(p＞0.05)。NBW组内，各时间点不同饲料组insulin~+细胞百分比与N-N组相比差异无显著性意义(p＞0.05)；LBW不同饲料组各时间点insulin~+细胞百分比与N-N组相比差异也无显著性意义(p＞0.05)。LBW组和NBW组胰岛ghrelin~+细胞比例均随着日龄增长出现下降趋势，且在1d～10d时间段下降幅度尤其显著。1d～8W各日龄LBW组大鼠胰岛ghrelin~+细胞数比例均高于NBW组(p＜0.05)。NBW组内，各日龄N-H组和N-P组胰岛ghrelin~+细胞百分比与N-N组相比差异无显著性意义；LBW组内，7d～4W时间段L-P组胰岛ghrelin~+细胞百分比高于L-N组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。LBW组和NBW组ghrelin~+细胞分布也存在差异，NBW组ghrelin~+细胞位于胰岛周边，随着日龄增长，位于胰岛周边的ghrelin~+细胞逐渐减少，少数12W大鼠胰岛甚至无ghrelin~+细胞存在。LBW组胰岛周边和中央区均有ghrelin~+细胞分布。随着日龄增长，胰岛中央区域的ghrelin~+细胞减少较快乃至消失，而周边部的胰岛ghrelin~+细胞逐渐减少，但12周LBW大鼠胰岛均有ghrelin~+细胞存在。四．结论1．宫内生长迟缓对体重和血ghrelin水平、胰岛素分泌的影响在生后持续存在。2．高脂高热能饮食能够诱发IUGR大鼠胰岛素抵抗，加重胰岛β细胞分泌缺陷；两者均对宫内营养不良大鼠后期高血糖的易感性起作用。3．高蛋白饮食能延缓或降低IUGR大鼠后期发生高血糖，胰岛上延缓消失的ghrelin表达可能对防止营养不良大鼠发生T2DM起一定保护性作用。