人参糖蛋白提取工艺、结构鉴定及其生物活性验证

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目的:随着我国人口老龄化的快速发展,老年痴呆的患病人数呈逐年上升期趋势,这一疾病在严重影响人们工作和生活的同时,也给每个患者的家庭以及全社会带来了巨大的压力。人参作为吉林省名贵中药材,具有独特的药用价值和保健作用,一直以来深受人们的重视。前期研究显示,人参糖蛋白(Ginseng glycoprotein GGP)具有显著改善学习记忆能力的生物活性。本实验将进一步优化GGP的提取工艺,对其进行理化性质及结构分析,并验证其生物活性,为研发抗老年性痴呆药物奠定基础。方法:人参药渣经水提,超滤,透析后得到GGP组分,对提取工艺进行筛选优化,确定GGP的最佳提取工艺;以葡萄糖为标准品采用苯酚硫酸法测定中性糖含量,以葡萄糖醛酸为标准品采用间羟基联苯法测定酸性糖含量,以牛血清白蛋白为标准品采用Lowry法测定蛋白质含量;采用高效液相凝胶色谱分析系统,以牛血清白蛋白(66430 Da)、VB12(1355.37 Da)、L-色氨酸(204.23 Da)、蛋白酶抑制剂(6500Da)、细胞色素C(13000 Da)作为对照品制作标准曲线,利用GPC软件计算GGP组分分子量分布;以单糖的衍生物作为对照品,将GGP组分PMP-柱前衍生化产物采用高效液相色谱法测定其组成糖;通过β-消除实验确定糖苷键的连接形式;采用甲基化方法,制备得到糖基化片段的部分甲基化部分乙酰化产物,利用GC-MS测定样品的糖连接方式;采用MTT法测定GGP对细胞活力的影响,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测GGP对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响,采用流式细胞实验检测细胞周期。结果:GGP组分的最佳提取工艺为,取100 g人参药材加8倍量的75%乙醇加热回流提取3次,分别为2 h,1.5 h,1.5 h,收集滤液;4000 rpm离心15 min,取上清液,冻干;将上述得到的冻干粉加水400 mL溶解,通过截留分子量为2.8 kDa的中空纤维超滤柱超滤3 h,得到超滤外液和超滤内液;将超滤外液浓缩,冻干;加入150 mL的水溶解,通过截留分子量0.1 kDa的透析袋透析12 h,得透析内液与透析外液,分别命名为T-1与T-2,T-1即为GGP组分;理化性质研究结果显示,T-1中的中性糖含量为37.92%,酸性糖含量为4.58%,蛋白含量为40.11%;分子量分布结果显示,分子量分布范围为778 Da-44325 Da,重均分子量为16605 Da;组成糖结果显示,T-1主要含有8种糖,分别为甘露糖(Mannose,Man)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、葡萄糖(glucose,Glc)、N-乙酰葡萄糖(azeglucose,GlcNAc)、N-乙酰半乳糖(GalNAc)、岩藻糖(fucose,Fuc),分别含量为4.96%、3.31%、10.58%、2.98%、49.85%、14.62%、2.51%、0.55%。β-消除结果表明GGP中多糖和蛋白质的连接方式包含O-糖苷键连接,确定其为GGP成分。细胞活性实验结果显示GGP可有效抑制Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞的凋亡,具有神经细胞保护作用。结论:本研究明确了具有改善学习记忆能力的GGP的最佳制备工艺,并对其进行理化性质及结构分析,验证其生物活性,为后续开发抗老年性痴呆药物奠定基础。
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