论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起,广泛分布于世界各养猪国家,给养猪业造成了巨大的经济损失。虽然自1987年首次发现该病以来人们对PRRS病毒开展了广泛的研究,并取得了一系列有意义的进展,但在病毒的分子致病机理和免疫机制等方面,人们还知之甚少,这也是目前研制安全、高效疫苗的主要障碍。白细胞介素10(IL-10)是一种多能的、在免疫调节和宿主防御反应中具有广泛效应的分子,研究发现激活IL-10的表达是多种病毒建立持续感染的一种十分有效的策略。那么PRRS病毒是否也通过上调IL-10的表达逃避宿主的免疫应答呢?为了阐明这一问题,开展了如下研究:1. PRRSV感染PAM细胞在mRNA水平和蛋白水平激活IL-10的表达通过real-time RT-PCR和ELISA检测PRRSV感染PAM细胞后不同时间点IL-10的表达情况,发现PRRSV感染后6h在mRNA和蛋白水平即显著上调IL-10的表达,并随着感染时间的延长,上调倍数逐渐增高。进一步以紫外灭活的PRRSV和不同剂量活的PRRSV分别感染PAM细胞,发现紫外灭活的PRRSV和未灭活的PRRSV均可诱导IL-10的产生,并且PRRSV剂量越高对IL-10的上调作用越显著,可见PRRSV诱导IL-10的表达存在病毒剂量依赖性。说明PRRSV编码的蛋白参与IL-10的激活,而且IL-10的激活与PRRSV的复制增殖密切相关。2. PRRSV诱导IL-10表达依赖MyD88,与TRIF、RIG-Ⅰ无关设计干扰分子psiTRIF、psiMyD88、psiRIG-Ⅰ分别转染PALM细胞,转染psiMyD88后,无论是在转录水平还是蛋白水平均可下调PRRSV诱导的IL-10表达,而转染psiTRIF、psiRIG-Ⅰ并不影响PRRSV诱导的IL-10表达。利用IL-10荧光素酶报告系统检测PRRSV感染Marc-145细胞和HEK293-CD163细胞后IL-10的表达情况,发现PRRSV感染Marc-145细胞可诱导IL-10的上调,48h尤为明显;而PRRSV感染HEK293-CD163细胞,IL-10的表达无明显上调,而HEK293-CD163缺乏TLRs,由此说明PRRSV感染诱导IL-10的产生与TLRs模式受体相关,并且依赖于MyD88,而与TRIF, RIG-Ⅰ无关。3. PRRSV激活IL-10的产生与转录因子NF-κB有关用不同浓度(1μM、5μM、10μgM、20μM)的NF-κB抑制剂BAY11-7082处理PAM细胞,PRRSV感染48h后收样,real-time RT-PCR和ELISA检测发现BAY11-7082处理显著下调PRRSV诱导的IL-10表达,并存在剂量依赖性;而抑制Iκκ3a后PRRSV诱导的IL-10表达水平显著上调,由此可见,NF-κB参与调控PRRSV上调IL-10的产生。4. PRRSV感染PAM细胞激活IL-10的产生与p38/MAPK通路有关用MAPK三条通路的特异性抑制剂SP600125、U0126、SB202190分别处理PAM细胞,PRRSV感染48h后收样,real-time RT-PCR和ELISA检测IL-10的表达水平,发现抑制剂SB202190对PRRSV诱导IL-10表达的抑制作用明显,U0126处理后IL-10的表达水平无明显变化,而高浓度的SP600125反而能促进IL-10的激活。SB202190对IL-10表达的抑制作用随抑制剂浓度的升高而逐渐增强。说明p38通路参与了PRRSV感染PAM细胞上调IL-10的过程,ERK1/2和JNK信号通路可能不参与PRRSV诱导IL-10的激活。