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利用转座子或T-DNA等标签构建的植物突变体研究基因功能时,需要明确标签在基因组中的插入位点,即获得标签序列的侧翼序列。目前已开发的侧翼序列分离方法均有其优势与不足之处,随着测序技术的不断进步与发展,分离侧翼序列的方法也应推陈出新。本实验室以下一代测序技术(Next-generation Sequencing,NGS)为基础,开发出了一种高效的分离标签序列的侧翼序列方法“侧翼序列标记测序”(Flanking sequence tagging-sequencing,FST-seq),此方法可以从一个样品中一次性分离多个标签的侧翼序列。FST-seq方法首先以Tn5转座酶复合体对基因组DNA进行打断的同时为DNA片段两端连上接头,再通过三轮PCR扩增富集包含标签序列的DNA片段并为其连接上NGS测序所需的完整Illumina接头,PCR产物经片段分选后可直接进行上机测序,无需额外的建库操作。测序数据下机后,通过我们的生物信息学分析流程即可获得标签序列的侧翼序列信息。本研究应用FST-seq在转基因小麦、水稻与玉米中分离T-DNA标签的侧翼序列从而确认T-DNA的插入位点,并对每个插入位点一一进行验证。具体来说,共分析了4种转基因植物材料,分别是河南大学转基因小麦植株、山东农业大学转基因小麦植株、韩国转基因水稻植株和河南农业大学转基因玉米植株。挑选其中基因组质量优良的转基因阳性材料,通过FST-seq方法在河南大学转基因小麦材料p2c-3中,从T-DNA的右边界分析得到了4个标签序列的插入位点,并通过PCR扩增成功验证了其中的3个位点;在韩国转基因水稻HT中找到了2个标签序列插入位点,在河南农业大学转基因玉米材料752-5和752-24中找到了相同的1个标签序列插入位点,均通过在标签序列和参考基因组中设计引物验证成功。不仅如此,本研究还通过FST-seq方法确认了T-DNA标签在基因组中的插入结构。对于河南大学转基因小麦材料,对T-DNA左边界可能的插入结构进行了分析,发现3个插入位点的T-DNA都存在正向串联重复现象且有2种串联重复方式,并通过PCR与Sanger测序确认了该结果。对于山东农业大学转基因小麦材料,共分析了6个样品,编号分别为A1、A2、A3、A4、B10、B11,但最终并没有分析到标签序列在小麦基因组中的插入位点。为了分析这一原因,利用NGS测序数据从T-DNA右边界的reads中发现2个插入位点的T-DNA存在正向串联重复现象,同样利用PCR与Sanger测序对此结果进行了验证。本研究应用FST-seq方法从基因组庞大且复杂的小麦及基因组较小的水稻和玉米中成功的分离到侧翼序列,并通过PCR等其他实验证明了此方法的准确性与实用性。