拟南芥和水稻m6A去甲基化酶相关基因突变体鉴定与功能初步探究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:weilai2010
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RNA上存在超过150多种化学修饰。其中,N6-甲基腺苷(N6-Methyladenosine,m6A)是目前发现最普遍、丰度最高的RNA化学修饰。在mRNA中m6A主要分布在终止密码子和3’-UTR附近,在5’-UTR处也有少量富集。m6A分布基序主要有两种:一种是 RRACH(R=G 或 A,H=U 或 A 或 C,且 U>A>C),另外一种是URUAY(R=A或G,Y=C或U)。前者在动、植物中均具有高度的保守性,后者仅在植物中高度保守。m6A修饰参与调控Pre-mRNA加工、可变剪接、核输出、mRNA的稳定性和翻译等生物学过程,对植物的生长、叶片形态建成、表皮毛形态等具有至关重要的作用。m6A修饰调控过程是动态、可逆的。相关m6A的作用酶主要包括:m6A甲基转移酶(Writer),m6A识别酶(Reader)和m6A去甲基化酶(Eraser)。拟南芥中m6A甲基转移酶MTA和MTB、FIP37形成复合体,共同介导m6A修饰的建立。m6A识别酶主要以ECT家族为代表,其中ECT2、ECT3和ECT4共同调控拟南芥的表皮毛和叶片形态调控等。m6A去甲基化酶是一类包含ALKB结构域的蛋白家族,拟南芥中的m6A去甲基化酶家族中含有5个基因成员:ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH1 0A和ALKBH1OB。其中ALKBH9B 主要参与拟南芥的病毒防御,ALKBHl 0B参与调控拟南芥的花形态建成。尽管ALKBH9B和ALKBHI0B已被报道,但是我们对植物中m6A去甲基化酶的相关作用机制仍旧了解较少。为了进一步探究拟南芥和水稻中m6A去甲基化酶的功能,我们在全基因组水平对拟南芥和水稻中m6A去甲基化酶进行了同源基因查找。拟南芥中,我们分离鉴定了m6A去甲基化酶基因家族的T-DNA插入纯合突变体,并构建了纯合多突变体材料。我们观察拟南芥单突变体和多突变体在营养生长时期的生长表型,发现突变体和野生型之间没有明显的表型差异。通过对拟南芥m6A去甲基化酶的表达模式的分析,发现ATIG14710的表达最高,它在拟南芥营养生长时期全株表达,生殖生长时期在花和果荚两端表达;其次是AT2G48080基因,它在根部,茎尖分生组织和花药中表达;再次是AT4G36090,它只在花药中表达。未检测到ATIG48980未找到它的表达位置。通过对AT1G14710基因的缺失功能突变体进行斑点印迹检测(Dot-blot),发现缺失该基因导致RNA的m6A修饰水平上升,说明AT1G14710参与调控m6A修饰的积累水平。在水稻中,我们利用CRISPR-Cas9技术创建了 m6A去甲基化酶基因的突变体,经过DNA水平和转录组水平检测,鉴定到了 3个基因的纯合体材料。水稻m6A去甲基化酶的CRISPR纯合突变体和日本晴对照相比,未出现明显的表型变化。最后经斑点印迹法(Dot-blot)检测,发现水稻m6A去甲基化酶基因LOCOs05g33310、LOCOs03g13560和LOCOsl0g02760突变体mRINA上的m6A水平与对照日本晴相比没有明显差异。综上,本研究鉴定并构建了拟南芥和水稻m6A去甲基化酶基因的突变体,并对部分基因的表达模式和功能进行了初步分析,发现了 AT1G14710基因参与调控拟南芥中m6A修饰积累水平。本研究为m6A去甲基化酶在植物中的后续功能研究提供了一定的理论参考。
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