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乳腺的氧化应激损伤是引起奶牛乳腺疾病发生率增加、产奶性能和乳品质降低的重要原因之一,深入探究维生素A(VA)减缓奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)氧化应激的机制对于维持奶牛的健康与持续高产具有重要意义。本论文以BMEC为模型,分别以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)、脂多糖(LPS)诱导BMEC氧化应激,以白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)拮抗白介素1(IL-1)受体,抑制IL-1生物活性,并利用小分子干扰RNA(siRNA)与过表达技术对谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)基因进行沉默与过表达,从Nrf2/GPx1/NF-κB信号通路深入研究了VA对BMEC氧化应激的预保护作用及其可能机制。论文分5个部分。试验1采用单因子完全随机试验设计,以DETA/NO作为NO供体,研究了不同剂量的VA(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4μg/mL)对细胞NO氧化损伤的预保护作用及其可能的作用机理。结果表明,NO诱导的氧化损伤显著降低了硒蛋白GPx、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及总抗氧化酶(T-AOC)能力,下调了GPx和TrxR的基因和蛋白表达;抑制了Nrf2信号通路的激活;增加了丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)浓度及炎症信号通路NF-κB的磷酸化水平,增强了下游IL-1β等炎症因子的基因表达。VA预保护组抑制了上述指标的相应变化,增加了视黄酸受体α(RARα)的蛋白表达;说明VA对细胞氧化应激的缓解作用与其降低了NO的生成有关。VA对BMEC的抗氧化能力的促进效果和对NO诱导的氧化损伤的缓解作用呈显著的一元二次剂量依赖效应。综合多项指标,以0.2~1μg/mL的VA效果较好,尤以1μg/mL最好。试验2以LPS作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,研究了不同浓度的LPS(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10.0μg/mL)分别作用细胞2、4、6、8、12和24h对BMEC的氧化损伤效果。结果表明,1.0μg/mL LPS作用BMEC6h,细胞的增殖率降低至73.20%;GPx、SOD和CAT活性均显著降低,IL-1、NO和MDA含量均显著升高。说明LPS的作用时间为6h,作用浓度为1.0μg/mL,可引起BMEC产生氧化应激,可作为建立细胞LPS氧化损伤模型的适宜剂量与作用时间。试验3在试验2的基础上,以LPS诱导细胞的氧化应激,采用单因子完全随机试验设计,研究不同剂量VA(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4μg/mL)对细胞LPS诱导的BMEC氧化应激的预保护作用及其可能的作用机理。结果表明,LPS诱导的氧化应激显著升高了NF-κBp65的基因表达、核因子κB抑制蛋白激酶β(IKKβ)、κB抑制蛋白α(IkBα)和NF-κBp65的磷酸化水平,即激活了NF-κB信号通路,增加了其下游IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的基因和蛋白表达,促进了NO的过量生成;LPS引起的氧化应激增加了Keap1的蛋白表达,抑制了Nrf2信号通路的活性,下调了硒蛋白GPx1的活性及其基因与蛋白质的表达;添加VA增加了RARα的蛋白表达,显著抑制了上述指标的变化。说明VA对LPS诱导激活的NF-κB通路及其下游因子IL-1β的表达具有显著的抑制作用,提示VA对LPS诱导的氧化应激的预保护作用可能与其抑制了IL-1的基因表达、进而降低了iNOS活性减少了NO的生成有关。VA对LPS诱导的细胞氧化应激损伤的预防性保护作用与VA的剂量呈一元二次剂量依赖效应,综合多项指标以0.5~2μg/mL较好,尤以1μg/mL最好。试验4在试验3的基础上,采用完全随机试验设计,以LPS诱导细胞氧化应激,利用IL-1ra抑制IL-1的生物活性,从IL-1/NO途径探究VA保护BMEC免受NO氧化应激的机理。将BMEC随机分为8组,分别是:空白对照组、VA组、LPS损伤组、IL-1ra组、VA+LPS组、VA+IL-1ra组、VA+LPS+IL-1ra组和LPS+IL-1ra组。结果显示,VA+LPS处理的VA预保护组、利用IL-1ra抑制了IL-1生物活性的LPS+IL-1ra组均可减缓由LPS诱导损伤引起的氧化应激,降低了NF-κBp65和NF-κBp50的基因表达、抑制了NF-κB信号通路中IKKβ、IkBα和NF-κBp65的磷酸化水平;降低了IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达和NO的浓度,说明LPS诱导的氧化应激是由于IL-1诱导了iNOS的基因与蛋白质表达引起NO的过量生成造成的,进一步验证了IL-1诱发的NO过量生成是造成细胞氧化应激损伤的重要因素。此外,VA预保护组显著增加了RARα的蛋白表达,提高了Nrf2的基因和蛋白表达,上调了GPx1的基因与蛋白表达;提示VA对LPS诱导的细胞氧化损伤的保护作用可能是通过Nrf2信号通路促进了下游抗氧化酶GPx1的表达,进而减少IL-1β的基因表达实现的。试验5在试验4的基础上,采用完全随机试验设计,以LPS诱导BMEC氧化损伤,将BMEC随机分为8个组,分别是空白对照组、LPS损伤组、VA+LPS预保护组、VA+LPS+GPx1siRNA组、VA+LPS+GPx1OE(GPx1过表达)组、VA组、LPS+GPx1OE组、VA+GPx1siRNA组,进一步从Nrf2/GPx1/NF-κB信号通路和IL-1-NO途径探究VA减缓BMEC氧化应激的机制。结果显示,VA+LPS+GPx1siRNA与VA+LPS组相比,GPx1和TrxR1的基因表达和蛋白表达均显著降低,炎症细胞因子IL-1β、IL-6、iNOS基因表达和蛋白表达以及NF-κB信号通路中NF-κBp65和NF-κBp50的基因表达以及IkBα和NF-κBp65的磷酸化水平均显著升高,说明VA对沉默GPx1基因的LPS诱导组引起的氧化应激无显著的减缓效果,沉默GPx1基因显著减弱了VA对LPS诱导的细胞损伤引起的IκBα和NF-κBp65的磷酸化水平增强的抑制作用,增加了IL-1β和iNOS的基因和蛋白表达,削弱了VA对细胞的保护作用。VA+LPS+GPx1OE组与VA+LPS组相比,GPx1的基因和蛋白表达、TrxR1和Keap1的蛋白表达均显著升高,炎症因子IL-1β的基因表达、iNOS的基因和蛋白表达、NF-κB信号通路中NF-κBp65和NF-κBp50的基因表达以及IKKβ的磷酸化水平均显著降低,Nrf2的蛋白表达显著降低。提示,GPx1过表达可以保护BMEC免受LPS诱导损伤。这些结果进一步验证了VA通过促进GPx1基因的表达减缓细胞的氧化应激。综上,本研究从Nrf2/GPx1/NF-κB途径探讨了VA促进BMEC抗氧化功能、调节NO生成以减缓氧化应激的机制,即VA通过激活Nrf2信号通路,增强了GPx1的基因和蛋白表达,抑制了NF-κB信号通路的磷酸化水平,进而降低了IL-1β和iNOS的基因与蛋白质表达,降低了NO的过量生成,减缓了细胞的氧化应激损伤。