【摘 要】
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鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，传统的防制办法还存在许多问题。DNA疫苗是一种新的生物技术疫苗，具有可靠的安全性、高稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等
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鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，传统的防制办法还存在许多问题。DNA疫苗是一种新的生物技术疫苗，具有可靠的安全性、高稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。5401基因是EtMIC4基因序列的一部分，编码EtMIC4蛋白的C末端区域，其重组蛋白对Eimeria tenella经口感染雏鸡能产生部分保护力。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产生，有着广泛的免疫调节作用，在鸡球虫保护性免疫中IFN-γ起着重要作用。本研究将柔嫩艾美耳球虫5401基因单独或与鸡IFN-γ、IL-2基因融合克隆入pVAX1.0制备免疫调节型DNA疫苗，并用构建的DNA疫苗免疫动物，检测对E.tenella攻虫的保护作用。 用RT-PCR方法，以ConA体外刺激培养6h的鸡脾脏淋巴细胞(SP)总RNA为模板，成功扩增出鸡γ-干扰素cDNA基因，并克隆入pMD18-T载体，序列测定结果显示其阅读框(ORF)为492bp，与GenBank上鸡γ-干扰素基因已知序列(U27465)BLAST的结果表明：核苷酸和氨基酸的同源性分别为99％和100％。将去除信号肽的ChIFN-γ基因克隆入pBV-220质粒，构建了pBV-220-ChIFN-γ原核表达载体，温度诱导后表达出蛋白大小为17kD。分别以孢子化卵囊及第二代裂殖子为材料，应用RT-PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)5401基因。测序结果表明该序列全长864bp，序列本身是一个开放阅读框，将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较，第174位和第287位发生突变，碱基分别由T突变为C，由C突变为T。第一个为无义突变，第二个突变引起第96位氨基酸由A变为V。其核苷酸序列同源性为99.8％，氨基酸同源性为99.7％。将5401基因克隆到重pGEX-4T-2获得组表达质粒pGEX-4T-2-5401，转入宿主菌BL21中，用IPTG进行诱导表达，表达的融合蛋白约90kD。利用DNA重组技术，分别构建pVAX1.0-5401、pVAX1.0-5401-IFN-γ、pVAX1.O-5401-IL-2 DNA疫苗。酶切鉴定正确后，分别用重组质粒免疫14日龄鸡，1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织，用RT-PCR，Western-blot方法检测保护性抗原的表达情况。结果表明5401基因、IFN-γ、IL-2基因均能在注射部位肌肉里成功表达。5401重组蛋白、 重组质粒pVAX1.0-5401、pVAX1.0-5401-IFN-γ、pVAX1.0-5401-IL-2经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡，并设立感染非免疫和非感染非免疫对照。28日龄经口接种新鲜的E.lene砌孢子化卵囊，一周后宰杀全部实验动物，进行盲肠病变计分、克粪便卵囊数、增重和综合抗球虫指数四个指标进行统计，检测其保护力的大小。结果表明，所构建的免疫调节型DNA疫苗对感染球虫鸡具有良好的保护效果，其中以pVAX1.0-5401-IFN-γ重组质粒组保护效果最好，有可能作为侯选的柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗。
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