一、研究背景目前肝部分切除术仍是治疗肝脏恶性肿瘤和肝门胆管癌首选的和最有效的方法,但大量肝组织被切除后残余肝脏能否代偿机体的功能需要是手术决策时必须面临的问题。而小肝综合征(small-for-size syndrome)及过度切取供体肝组织所导致的受体和供体的肝功能失代偿也阻碍着活体肝移植的广泛开展。肝脏具有强大的再生能力,随着生物实验技术的不断发展,人们在肝再生的分子机理和调控机制进行了大量的研究,特别是转基因和基因敲除小鼠动物模型的应用使肝再生的分子生物学研究取得突破性进展。肝再生的研究较多使用肝叶切除模型。大鼠行70%肝切除后,其肝脏体积可在大约1周左右时间得到完全恢复。肝再生增殖主要依赖于剩余肝组织的分化成熟的细胞重新活化,获得增殖活性,启动后续的DNA复制、细胞分裂和增殖。不同类型的非实质细胞能分泌各种细胞因子作用于肝细胞并相互作用,从而对肝再生进行精确的调控。门静脉结扎模型在上世纪20年代即已有研究者使用,但未引起普遍重视,直至上世纪末因根治切除肝门部胆管癌而常需切除大量肝组织时才再次兴起了对门静脉结扎促进肝再生的研究。目前的研究结果表明部分门静脉分支结扎后2周左右残留肝再生达到高峰,大大提高了肝门部胆管癌的根治性切除率。这说明门静脉压力变化可能与肝脏的再生有着密切的关系。肝再生过程中受到许多细胞因子和生长因子等的调控,且它们在肝再生过程中具有不同的生物学作用,肝脏再生的启动与终止均有这些相关因子的参与。核转录因子(NF-κB)是多种信号转导途径的汇聚点,其诱导产生的白介素-6(IL-6)在各种各样的基因调节的炎症、增殖反应中起关键作用。近年来国内外有关学者已对NF-κB和IL-6在大鼠PH模型中作为启动肝再生的细胞因子做了大量研究。PH术后,创伤可刺激肝细胞迅速释放TNF-α及其他细胞因子,从而激活NF-κB,发生核转移,其下游基因随之活化,由于IL-6基因主要有3个顺式结合位点:NF-κB、C/EBPβ、AP-1,因此IL-6表达增加。IL-6与其受体复合物(gp130/IL-6Rα)结合,激活JAK激酶,使STAT1和STAT3发生磷酸化,活化的STAT3和其他的转录因子(C/EBPβ、AP-1)增强一些与细胞增殖有关因子的表达,如c-myc、c-fos,协同生长因子(如HGF、EGF等)促进细胞发生有丝分裂,进行增殖,同样也激活了下游的MAPK信号通路,而该通路也可以促进与生长、分化、分裂有关的基因的表达,介导组织细胞的增殖。但其是否在肝再生中发挥重要作用,目前文献报道尚少。尽管既往已经从不同角度进行了大量的研究和探索并已取得了一些初步的结论,但大多数研究均是以肝叶切除为模型,或是以肝细胞的增生为研究主体,因而结果及结论均有一定的局限性。本实验通过建立90%极限门静脉分支结扎动物模型,研究NF-κB、IL-6等细胞因子在极限门静脉分支结扎导致的肝再生过程中的作用机制。二、课题思路(1)建立90%极限门静脉分支结扎动物模型,为临床上对晚期特大肝癌和广泛肝内胆管结石患者手术前进行预处理而避免肝衰竭的发生提供理论依据。(2)探讨NF-κB与IL-6在90%极限门静脉分支结扎大鼠的肝再生过程中的作用机制。三、材料与方法雄性Sprague-Dawley大鼠96只,体质量(220±20)g,由四川大学实验动物中心提供。实验大鼠随机分为2组:实验组和对照组各48只,每组又随机分为8个亚组,每组6只,分别为术后0.5d组、1d组、3d组、5d组、7d组、14d组、21d组和28d组。实验组:1.动物模型制作:采用1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。参照文献方法,由正中纵切口开腹,手术显微镜下以4-0丝线结扎供应肝右叶及尾叶的门静脉右支和供应左外叶及中叶的门静脉支,只留下一细小的通向二乳突叶的门静脉支未结扎,肝动脉及胆管保持完整。被结扎侧肝脏约占全肝质量的90%。2.测定PVP:将每组达到相应观察时间尚存活的大鼠经肠系膜总静脉向门静脉主干插管后测定门静脉压力(PVP),并立即处死大鼠取肝脏组织做相应检测和观察。3.观察指标:(1)观察肝脏的色泽和质地,用电子天平分别测量各组大鼠的总肝质量和非结扎侧肝叶质量,计算非结扎侧肝叶所占百分比。(2)非结扎侧肝叶常规固定包埋及切片,HE染色观察病理结构的改变。(3)免疫组化S- P法对非结扎侧肝叶肝细胞增殖(PCNA)进行检测分析,计算其平均阳性率。(4)采用原位末端标记技术(TUNEL法)对非结扎侧肝叶肝细胞凋亡进行定量分析,计算其平均阳性率。(5)免疫组化S- P法检测非结扎侧肝叶肝组织NF-κB、IL- 6的表达,并测定其平均累积光密度值(IOD)。对照组:假手术组仅游离出门静脉分支,不结扎即关腹,其他实验过程同实验组。四、结果(1)48只90%PBL实验组大鼠中46只存活(21d组和28d组各死亡一只),总存活率为95.8%。(2)结扎侧肝叶肝脏颜色变暗,逐渐开始萎缩,非结扎侧肝叶占总肝质重的比例随时间推移而增加,12h内增加较缓慢,而24h-5d则增加速度明显加快,5d以后呈缓慢增加,7d达“平台期”,重量比例增加进一步变缓。全肝总质量仅在术后第1d-3d略低于正常水平,其余时间点则与正常水平接近,差异无统计学意义。(3)门静脉分支结扎后门静脉压力随即升高,12h达到高峰(P<0.01),12h-5d逐渐下降,但仍高于正常水平。7d-28d则与正常水平接近,差异无统计学意义。(4)对照组大鼠肝脏显示以中央静脉为中心肝细胞呈放射状排列。门静脉分支结扎术后非结扎侧肝脏显示术后12h肝细胞轻度肿胀,汇管区、小叶间血管、胆管界限清楚;术后第l d肝细胞即开始明显的增殖.有较多的分裂相存在,伴有核增大,汇管区、小叶间血管扩张充血;术后3d-5d肝细胞核分裂活跃,汇管区见炎细胞浸润;术后第7d-14d亦可见较多的分裂相,肝细胞核增大;术后第21d-28d可见间质少量炎细胞浸润。小胆管增生,肝索结构清楚,肝窦清楚。(5)对照组大鼠肝组织中有少量PCNA表达。术后非结扎侧肝叶12h开始PCNA的表达量呈显著增加(P<0.01),可见较多PCNA阳性细胞;至术后5d达高峰(P<0.01),可见大量PCNA阳性细胞;自7d-14d逐渐下降,但仍高于正常水平(P<0.05),术后21d恢复至术前水平(P>0.05),仅见少量PCNA阳性细胞。(6)对照组大鼠肝脏和实验组术后非结扎侧肝脏仅见极少量凋亡细胞。(7)对照组肝细胞胞质可见少量NF-κB和IL-6表达,极少见核表达,实验组非结扎侧肝叶NF-κB和IL-6的表达术后逐渐增加,并可见核阳性表达细胞,分别至术后1d和0.5d达高峰,随后逐渐减少,直至恢复至术前水平(P>0.05)。(8)门静脉压力在术后1d组、3d组、5d组和非结扎侧肝叶肝细胞PCNA的表达呈正相关,在术后14d组与非结扎侧肝叶肝细胞PCNA的表达呈负相关;大鼠肝脏PCNA的表达在术后0.5d、1d、14d、21d、28d组与肝内NF-κB表达呈正相关;大鼠肝脏PCNA的表达在术后1d、14d、21d组与肝内IL-6表达呈正相关;大鼠肝脏NF-κB的表达在术后1d、7d、21d、28d组与肝脏IL-6表达呈正相关。五、结论90%门静脉分支结扎术后引起未结扎侧肝细胞的活跃再生,再生后的肝脏可恢复原来的重量,大鼠90%门静脉分支结扎术可作为一种研究肝脏再生的较好模型;门静脉分支结扎术后门静脉压力变化,在此过程中可能激活NF-κB信号通路,IL-6蛋白分泌增加,从而在促进肝细胞的增殖效应中发挥重要作用。