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背景膀胱癌是目前泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。虽然局限性膀胱肿瘤能通过外科手术切除而得以控制,但目前对于膀胱癌术后的高复发和高转移率临床仍然缺少有效的控制手段。我们对膀胱癌的发病原因和进展机制所知甚少,除了常见的流行病学和遗传学因素,许多错综复杂的分子事件是导致肿瘤细胞形成、进展和转移的深层次原因。miRNA是真核生物体内一种高度保守的,长度为20-24个核苷酸的非编码RNA,其在人体组织器官内的表达分布具有明显的时空特异性,不同的组织细胞、同一生物体的不同发育阶段呈现出不同的表达谱。miRNA参与了细胞生长、发育、免疫应答、周期、凋亡、衰老、运动等多个生理过程。国内外研究者已在包括膀胱癌在内的多种肿瘤内发现了异常的miRNA表达谱,肿瘤细胞内相较正常细胞呈现差异化表达的miRNA,往往在肿瘤的发生发展中起到了关键作用,其中低表达的miRNA在肿瘤细胞中多起到抑癌基因的作用。本研究希望在膀胱癌中寻找异常表达miRNA,并进一步揭示其在肿瘤基因调控中的作用。目的在收集到的膀胱癌患者手术切除标本中采取实时荧光定量PCR的方法检测miR-608的表达水平,分析影响miRNA表达的表观遗传学机制。以获得性功能实验观察miR-608对膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3的一系列生物学功能的影响。以生物信息学分析为基础,预测miR-608潜在的的调控靶点,通过对靶点基因的沉默和过表达实验,验证miR-608对靶点调控的意义,并进一步探索调控中存在的分子机制。方法1.在13对膀胱癌组织标本中检测miR-608的相对表达量,对膀胱癌组织及与其配对的正常膀胱粘膜上皮组织中的miR-608表达差异进行统计,并对不同病理分期与分级的膀胱癌中miR-608表达水平的差异进行分析。2.通过对T24和UM-UC-3膀胱癌细胞株体外转染miR-608 mimic(模拟体)的方式来进行一系列获得性功能实验。以CCK-8、平板克隆形成、流式细胞周期和凋亡检测、划痕实验以及Transwell小室迁移和侵袭、活体成瘤实验来分析miR-608过表达对肿瘤细胞增殖与侵袭迁移功能的影响。3.利用在线生物信息学工具,预测并挑选miR-608作用的靶基因,然后用Western Blot、Real Time PCR等检测手段在上述细胞株内验证miR-608预测结合的靶点蛋白基因的mRNA及蛋白水平的相应变化,通过构建萤火虫荧光素酶双报告质粒对miR-608所作用的靶基因3’-UTR结合位点进行验证,最后通过小RNA干扰和过表达拯救等实验来最终证实miRNA和靶点基因的存在的靶向调控关系。结果1.收集的13例膀胱癌病人的肿瘤组织标本中,miR-608的表达水平均显著降低,相对于配对癌旁组织,膀胱癌组织中miR-608的平均表达量下降了2/3,肌层与非肌层浸润性膀胱癌以及高级别与低级别膀胱癌之间的miR-608的表达水平显示出一定的差异,但无显著的统计学意义。2.膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3中miR-608的启动子区CpG岛呈现高度甲基化状态,提示DNA甲基化可能与miR-608在膀胱癌中的低表达有关。3.体外转染miR-608 mimic至T24和UM-UC-3细胞株以过表达miR-608,可明显抑制其生长。50nM浓度的miR-608 mimic即可明显抑制膀胱癌细胞的体外增殖能力,流式细胞周期检测发现miR-608过表达可诱导上述两种膀胱癌细胞发生G1期阻滞,miR-608过表达还可抑制膀胱癌细胞体外克隆形成能力。同时,miR-608过表达还可显著抑制UM-UC-3细胞株在裸鼠体内的成瘤能力。细胞凋亡检测提示miR-608过表达并不能诱导细胞凋亡,而Transwell小室和划痕实验则提示miR-608抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的作用同样并不显著。4.通过在线生物信息学软件分析与文献报道的相关芯片数据结果相结合,预测FLOT1可能是miR-608的作用靶基因。同时,在过表达miR-608后,检测到的靶基因FLOT1在mRNA水平和蛋白水平都有显著下调。进一步的荧光素酶双报告实验结果证实FLOT1是miR-608的直接作用靶点,其3’-UTR中存在miR-608调控的作用序列。5.通过细胞信号通路分析,我们发现在过表达miR-608或FLOT1的小干扰RNA (siFLOTl)之后,检测到AKT/FOXO3a信号通路和细胞增殖相关的关键蛋白的mRNA水平和蛋白水平都发生了相应下调,证明了miR-608靶向FLOT1抑制膀胱癌增殖能力的作用机制,是通过AKT/FOXO3a信号通路得以实现的。结论1.与配对癌旁组织相比,膀胱癌组织中miR-608的相对表达水平较低,但是本研究未能提示miR-608表达量与膀胱癌的恶性程度相关；miR-608在膀胱癌当中的低表达水平,可能受其启动子区CpG岛甲基化状态的表观遗传调控。2.体外转染mimic过表达miR-608可使膀胱癌细胞株发生细胞周期阻滞进而抑制其增殖能力。同时,miR-608的过表达还削弱了膀胱癌癌细胞的克隆形成能力,但是对膀胱癌细胞凋亡及侵袭迁移能力并无明显影响。3. FLOT1是miR-608的直接作用靶点,miR-608靶向FLOT1影响其下游的AKT/FOX03a信号通路,进而发挥抑制膀胱癌的增殖能力的作用。