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第一部分生长追赶IUGR大鼠脂肪细胞功能研究目的近年来大量资料表明宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)与肥胖、高血压、高脂血症及2型糖尿病密切相关。胰岛素抵抗是这些代谢紊乱疾病的中心环节。研究显示,IUGR生后早期追赶生长尤其是脂肪组织的快速追赶生长可能与其胰岛素抵抗有关。本研究旨在探讨4周龄追赶生长IUGR幼鼠脂肪细胞功能的改变和相关脂代谢关键酶的变化,以深入研究生长追赶IUGR脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制。方法母孕期饥饿法建立IUGR新生大鼠模型。雌雄清洁级SD大鼠3：1合笼后以镜检阴道涂片见精子为受孕第一天(d1)。受孕鼠随机分为限食组和正常饮食组,限食组给予正常组30%的饲料喂养。分娩后每只限食母鼠留取5只体重<5.1g仔鼠作为追赶生长IUGR模型组(catch-up growth IUGR, IUGR-CG),每只正常饮食母鼠哺乳8只正常仔鼠作为对照组(appropriate for gestational age, AGA),3周断乳。出生及生后每周测量幼鼠身长体重。4周龄时,随机挑选20只IUGR-CG功鼠和24只AGA幼鼠,禁食12h后尾部毛细血管采血测空腹血糖、血清胰岛素、脂联素、促酰化蛋白及TC、TG、HDL、LDL水平,并计算胰岛素抵抗指数。此后间隔3日再禁食8h行OGTT试验。随后颈椎脱臼法处死幼鼠,无菌条件下取腹股沟或附睾白色脂肪组织,胶原酶消化法原代培养前脂肪细胞和成熟脂肪细胞。结晶紫法检测前脂肪细胞的增殖能力变化。用经典的“鸡尾酒”法诱导前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,观察分化过程中脂肪细胞的形态变化；Western-blot检测前脂肪细胞成熟过程中脂代谢关键酶DGAT和LPL蛋白表达水平；Western-blot检测成熟脂肪细胞IRSs通路信号因子IRS1/2、PI3K水平变化以及负性调节因子SOCS1/3变化。结果①身长体重变化：追赶生长IUGR (IUGR-CG)组幼鼠在第1周体重、身长均显著低于同龄AGA组(p<0.001),但从第2周起IUGR-CG组幼鼠体重开始超过同龄AGA组,直至第四周。身长在第2周追赶上AGA组(p>0.05),3周时明显超过AGA组(p<0.001),但4周末落后于AGA组(p<0.05)。②糖脂代谢：IUGR-CG组幼鼠空腹血糖维持在正常水平,但空腹血清胰岛素、血脂及ASP水平均明显高于AGA组,血清脂联素水平降低。OGTT试验中IUGR-CG组幼鼠血糖水平于注射葡萄糖后各点值均显著高于相同时间点AGA组。③前脂肪细胞增殖能力：IUGR-CG组前脂肪细胞在第6天时增殖能力显著高于正常对照组(p<0.05),之后其增殖能力有超过AGA组趋势。④前脂肪细胞分化成熟过程中, IUGR-CG组LPL蛋白表达水平从分化4d天显著高于AGA组。而DGAT同AGA组相比,表达出现较早,且从分化2d起表达水平更高。ⅠUGR-CG组成熟脂肪细胞IRS-1/2及PI3K蛋白表达减少,SOCS1/3蛋白表达增多。结论追赶生长IUGR幼鼠存在明显的胰岛素抵抗、血脂紊乱、糖耐量降低和脂肪细胞分泌因子ASP水平增高、脂联素水平降低。前脂肪细胞成熟过程中,脂代谢关键酶DGAT和LPL的升高与追赶生长IUGR脂肪细胞功能紊乱有关,IRSs信号通路下调及SOCS1/3表达增多与胰岛素抵抗有关。第二部分前脂肪细胞分化成熟过程中]RS1/2, SOCS1/3基因沉默以及PI3K抑制对C/EBP a, PPAR γ表达的影响目的：观察脂肪细胞IRS1/2、SOCS1/3基因沉默对C/EBPα、PPARy表达的影响；观察PI3K抑制对C/EBPα、PPARy的影响。探讨胰岛素信号途径分子变化对前脂肪细胞分化成熟的影响方法：原代培养前体脂肪细胞,鸡尾酒法诱导其分化成熟(方法见第一部分)。构建含IRS1/2、OCS1/3shRNA的质粒,然后感染前体脂肪细胞,以含无效shRNA的质粒作为阴性对照。Western blot和Real-time PCR检测前体脂肪细胞分化成熟过程中0d,3d,7d,9d时C/EBPα、PPARy的表达变化。另一方面,在细胞分化成熟过程中加入PI3K抑制剂LY294002, Western blot和Real-time PCR检测抑制前后C/EBPα、 PPARy的表达变化结果：与对照组相比：1)IRS1/2基因沉默后WB和Real-time PCR均显示C/EBPα、 PPARy表达下调,3d时即与对照组有显著性差异(p<0.05)。2)SOCS1/3基因沉默后,WB结果C/EBPα、 PPARy表达下调,3d时与对照组有显著性差异(<0.01),Real-time PCR结果与WB结果相似；3)加入PI3K抑制剂后,C/EBPα、 PPARy在WB和Real-time中均显示出表达下调,在加入抑制剂第4d即显示出与对照组有显著性差异。(p<0.05)结论：前脂肪细胞分化成熟过程中,IRS1/2、SOCS1/3基因沉默可使C/EBPa、 PPARγ的表达下调,抑制PI3K的活性同样可抑制其表达