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假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)是一种重要的植物根际促生菌,能产生多种抑制植物病原菌的次级代谢产物,是生物防治制剂研究模式菌株,分布及其广泛,是植物根际环境中相对丰度很高的菌属。假单胞菌Pf-5 retS mutant突变株是实验室前期构建的工程菌株,通过突变假单胞菌Pf-5的retS基因从而提高了生物防治功能。斯氏假单胞菌DSM4166(Pseudomonas stutzeri DSM4166)全基因组序列已经公布,固氮基因簇nif注释清楚,能够进行生物固氮,但还没有生物防治的有关报道。同时具备固氮和生防作用的菌株很少,为了获得一株可广泛分布的既固氮又生防的多功能根际促生细菌,本研究通过在Pf-5和Pf-5 retS mutant菌株中异源表达DSM4166的固氮基因簇nif,构建了突变菌株Pf-5-nif和Pf-5 retS mutant-nif,成功实现了固氮基因簇的异源表达。本研究主要结果总结如下:1、将DSM4166的固氮基因簇nif通过接合转座的方式随机插入到Pf-5和Pf-5 retS mutant基因组中。2、通过乙炔还原法筛选到固氮酶活性高的Pf-5-nif和Pf-5 retS mutant-nif突变工程菌株。3、通过植物表型分析,确定了工程菌株的固氮生防效果。本研究通过nif基因簇的异源表达,从而构建了一株可广泛分布的兼具生物固氮和抑菌功能的根际促生细菌,能够在作物根部高效的靶向生物合成生物氮肥和生物农药,对实现化肥农药的减施增效具有重要意义,有利于绿色农业可持续发展,进一步保证了环境改善和食品安全。埃博霉素(epothilone)是一类聚酮类化合物,由粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生,作用于细胞微管蛋白,通过稳定微管结构抑制有丝分裂,从而抑制肿瘤细胞的生长。其分子量小,水溶性好,作为极具潜力的抗癌药物,迅速成为国内外生物和医药学等多个领域的研究热点。目前,埃博霉素主要通过微生物发酵进行生产制备,由于其原宿主菌代时长,遗传改造困难,所以异源表达成为研究的重点。白色链霉菌J1074(Streptomyces albus J1074)作为表达次级代谢产物的常用宿主菌,生长代时短,遗传操作体系成熟,可以作为改造提高埃博霉素基因簇表达水平的异源宿主,降低埃博霉素的生产成品,并且可以对埃博霉素基因簇进行遗传改造,产生更有临场药用价值的新型埃博霉素类似物。本实验室前期对埃博霉素基因簇成功进行克隆,而本研究对直接克隆质粒进行改造,主要结果总结如下:1.在成功克隆的埃博霉素基因簇上对转录调控进行遗传改造,添加不同数量的强启动子。基因的转录量是表达调控很重要的一步,而启动子又在转录过程中发挥着很重要的作用。因此本研究首先在埃博霉素的每个基因簇前加一个J1074中挖掘的强启动子,依次观察加入不同数量启动子的埃博霉素表达情况。实验结果表明依次在epoA、epoB、epoC加入前三个启动子时,加入的启动子越多,埃博霉素的产量越高。2.通过接合转移转到本实验室常用的宿主菌白色链霉菌J1074中进行异源表达,为之后的实验摸索了条件。本研究实现了埃博霉素基因簇在异源宿主白色链霉菌J1074中的高效生物合成,为研究外源复杂化合物基因表达在链霉菌底盘中的适配机制奠定了基础,同时也为复杂生物合成途径的人工设计提供新思路和新方法。