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目的铁死亡作为新发现的一种具有独特信号通路的细胞死亡模式,其关键特征为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性降低导致细胞膜脂活性氧簇(ROS)蓄积,而膜脂ROS过量产生诱发脂质过氧化损伤也是溃疡修复障碍的病理机制之一。过量ROS攻击DNA、脂质以及蛋白质等生物大分子,导致细胞凋亡过度与增殖不足,造成机体组织损伤。研究表明糖尿病溃疡创面因长期处于高糖环境,细胞过度氧化应激,致使膜脂ROS蓄积。既往研究证实高糖环境下GPX4辅助作用因子谷胱甘肽耗竭也可导致ROS蓄积,激活脂质过氧化反应,造成细胞的过度凋亡,减弱成纤维细胞和角化细胞的增殖和迁移能力,进而损伤神经和微血管,抑制创面肉芽组织形成和上皮细胞增殖,严重影响组织修复再生能力,这些现象表明糖尿病溃疡的病理环节中可能存在铁死亡途径。本研究聚焦糖尿病溃疡愈合障碍难题,旨在揭示铁死亡通路与糖尿病溃疡发生发展的内在联系,探索铁死亡抑制剂Ferrostatin-1对修复糖尿病溃疡的重要作用及其分子机制。方法通过构建高糖诱导细胞损伤模型与糖尿病溃疡动物模型,从细胞及动物水平明确铁死亡在糖尿病溃疡病理过程中的重要作用,揭示铁死亡与糖尿病溃疡愈合障碍之间的内在联系,阐明Ferrostatin-1修复糖尿病溃疡的分子机制。(1)评价Ferrostatin-1对细胞损伤模型的修复功能。构建高糖诱导成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(EA.hy926)损伤模型,采用CCK-8法摸索细胞适宜药物干预浓度,将适宜浓度的Ferrostatin-1和铁死亡诱导剂(RSL-3)分别作用于高糖环境下的HSF和EA.hy926细胞,通过实时荧光定量PCR(q PCR)和Western blot技术检测细胞内GPX4、SLC7A11、TFRC基因和蛋白表达变化,利用荧光探针标记法和试剂盒检测细胞内总ROS、线粒体ROS及丙二醛(MDA)含量并进行细胞划痕实验和血管再生实验,验证高糖环境下细胞损伤模型中是否存在铁死亡途径,探讨Ferrostatin-1对高糖诱导细胞损伤模型的修复能力。(2)探索Ferrostatin-1修复糖尿病溃疡新途径。连续动态观察糖尿病动物溃疡模型再上皮化速率评价创面修复能力,采用光镜、电镜、q PCR、Western blot等检测方法,观察组织细胞形态以及GPX4、SLC7A11、TFRC基因及蛋白表达和MDA含量变化,同时运用ELISA技术检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达情况,通过H&E染色和免疫组化技术,检测溃疡创面肉芽组织内PCNA、VEGF的表达情况,并评估各组溃疡修复情况,进而揭示Ferrostatin-1抑制铁死亡促进溃疡修复的作用机制。(3)研究Ferrostatin-1修复溃疡的分子机制。通过Western blot技术检测各组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值以及VEGF在各组间的表达差异,探讨Ferrostatin-1能否通过激活PI3K/AKT信号通路抑制细胞死亡,促进细胞增殖及迁移能力,从而加速糖尿病大鼠背部溃疡创面愈合。结果本研究成功摸索出Ferrostatin-1以及RSL-3适宜的细胞干预浓度,将其应用于高糖诱导的HSF及EA.hy926细胞损伤模型。相较于高糖组和RSL-3干预组,Ferrostatin-1干预后的细胞损伤模型组中,铁死亡抑制因子GPX4、SLC7A11的基因和蛋白表达量显著升高,而铁离子受体TFRC显著降低,脂质过氧化产物MDA、总ROS、线粒体ROS含量显著减少,HSF的24 h细胞迁移率较高,EA.hy926细胞内VEGF、e NOS的基因和蛋白表达量增加。动物实验结果表明,相较于糖尿病大鼠溃疡对照组,Ferrostatin-1干预组的大鼠背部溃疡创面愈合速率加快,且溃疡创面肉芽组织中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量较低,PCNA和VEGF表达量较高,组织电镜下可见线粒体的体积变小,嵴消失,呈空泡样改变,符合铁死亡镜下形态特征,GPX4、SLC7A11的基因和蛋白表达量增加,TFRC表达量较少,MDA含量较低。此外,Ferrostatin-1干预组的p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT的蛋白表达量比值较糖尿病大鼠溃疡组及RSL-3干预组有增高趋势,说明Ferrostatin-1通过激活PI3K/AKT通路抑制细胞铁死亡从而促进溃疡创面组织再生。结论本研究从细胞和动物水平初步验证了糖尿病溃疡病理环节中存在着铁死亡这一细胞死亡模式,而Ferrostatin-1可抑制细胞铁死亡,并显著改善受高糖诱导损伤的成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移和再生能力,减轻糖尿病大鼠溃疡创面皮肤肉芽组织的脂质过氧化损伤和炎症活动,加速糖尿病溃疡创面愈合。本研究可为糖尿病溃疡修复的基础研究提供新的理论依据,有望为糖尿病难愈性溃疡的治疗方式开辟一条新思路。