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膀胱癌是人类重大疾病之一,具有发病率高和术后易复发等特点。巴西苏木素为中药材苏木的有效成分,课题组前期利用MTT技术分析发现巴西苏木素能够显著降低人类移行膀胱癌T24细胞的活性,并对药物处理前后的T24细胞进行了数字基因表达谱分析。本文在课题组已有的研究基础上,采用quantitative Real-time PCR (qPCR)技术对数字表达谱中筛选的差异表达基因进行验证,对其中表达量变化显著的GADD45β基因进行进一步分析；分析巴西苏木素处理不同种类肿瘤细胞的毒性作用和c-Fos、GADD45β的表达差异；分析小鼠胎儿成纤维细胞对巴西苏木素的毒性反应及安全性评估。主要内容如下：一、GADD45β在巴西苏木素致死膀胱癌细胞中的作用根据实验室巴西苏木素处理膀胱癌T24细胞的数字基因表达谱结果,利用qPCR验证差异表达基因,结果发现与生长阻滞和DNA损伤相关的基因GADD45β显著上调2.7倍。进一步的qPCR检测发现,GADD45β在巴西苏木素处理T24细胞3h、6 h和12 h后均显著上调,暗示该基因在巴西苏木素致死T24细胞中起重要作用。通过构建GADD45β真核表达载体,转染T24细胞,使GADD45β在T24细胞中超表达,模仿巴西苏木素处理后GADD45fβ基因的上调,从而分析GADD45β基因是否参与细胞生长抑制和致死过程。结果表明,转染重组载体与转染空载体相比,GADD45βmRNA的表达量上调60多倍。GADD45β超表达后,T24细胞形态发生显著变化,与转染空载体的对照组相比,细胞变圆,贴壁性变差,细胞活性显著降低了84.55%。表明GADD45β在巴西苏木素致死T24细胞的过程中可能发挥重要作用。二、巴西苏木素对不同肿瘤细胞的毒性作用及c-Fos和GADD45β的mRNA表达变化利用对T24细胞半致死浓度32 μg/mL的巴西苏木素处理人肺癌细胞Spc-A-1、人肝癌细胞Smmc-7721、人宫颈癌细胞Hela229和小鼠黑素瘤细胞B16,研究其对不同肿瘤细胞的毒性作用。MTT检测发现,巴西苏木素对这四种肿瘤细胞都有不同程度的致死效应,表明巴西苏木素的抗癌活性具有广谱性。课题组前期工作发现,c-Fos在巴西苏木素处理膀胱癌T24细胞后mRNA及蛋白的表达显著上调,c-Fos在T24细胞中超表达后可致细胞活性降低66.22%。本研究中我们发现了GADD45β在巴西苏木素致死T24细胞中的重要作用,表明巴西苏木素可能通过c-Fos和GADD45β致死膀胱癌T24细胞。为了进一步研究巴西苏木素致死不同肿瘤细胞的作用途径是否一致,我们检测了巴西苏木素处理不同肿瘤细胞后c-Fos和GADD45β的mRNA表达变化,qPCF检测结果发现药物处理6h后c-Fos仅在T24细胞中显著高表达,而在其他四种肿瘤细胞中均无显著变化；GADD45β在T24. Spc-A-1、 Hela229和Smmc-7721细胞的表达均发生了显著性上调。表明巴西苏木素通过c-Fos致死T24细胞的作用是特异的,而对GADD45β表达的影响与其它癌细胞一致。三、巴西苏木素对正常细胞的影响为了科学评估巴西苏木素作为药物的安全性,本文研究了巴西苏木素对正常细胞的影响。首先成功制备小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),用不同浓度的巴西苏苏木素分别处理第二代MEF和T24细胞,采用MTT法测定细胞的活性,结果表明,5个不同的处理浓度下,MEF的活性均显著高于T24细胞的活性。32 μg/mL巴西苏木素处理6 h, MEF细胞活性较T24细胞活性相对提高60%。表明巴西苏木素对肿瘤细胞有一定的特异性,对正常细胞毒性小,安全性较好。