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人牙髓干细胞(Human Dental Plup Stem Cells,hDPSCs)是存在于牙髓组织中具有干细胞性质的未分化间充质细胞,具有多向分化潜能,可形成功能性的成牙本质细胞和牙本质。神经营养素(Neurotrophins, NTs)是一类多功能生长因子家族,在牙胚的发育过程中有表达,对牙胚发育过程中成牙本质细胞的分化有调节作用,是牙齿发育多因素网络调节以及牙髓修复的重要组成部分。研究发现,NTs对体外培养的牙髓细胞的增殖、分化及钙化均能发挥作用,可能参与调节成牙本质前体细胞的分化。NTs是否在hDPSCs中有表达?NTs是否能促进hDPSCs的增殖和分化?目前尚无有关这一问题的研究报道。本课题在对人牙髓干细胞体外分离、培养和鉴定的基础上,检测NTs在干细胞中的表达,分析NTs对人牙髓干细胞生长特征的影响,为探讨影响人牙髓干细胞增殖和分化的因素,以及NTs在牙齿发育与牙齿损伤修复中的可能作用和应用,提供参考依据。本实验分为三个部分:第一部分:分离培养人牙髓干细胞并进行细胞鉴定。收集临床上因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙,采用酶消化法分离获得牙髓细胞,克隆化分离培养hDPSCs;观察hDPSCs的生长状态和细胞形态;计算细胞克隆形成率;免疫组化检测细胞表型,进行细胞的鉴定。结果:牙髓干细胞增殖快,细胞呈集落状生长,集落形成率为4～28个克隆/104细胞;免疫组化染色显示细胞波形丝蛋白和STRO-1阳性表达,角蛋白阴性表达。第二部分:检测hDPSCs中NTs的表达。采用RT-PCR检测细胞中神经营养素mRNA水平的表达;采用免疫组化和western blotting检测细胞中神经营养素蛋白水平的表达。结果:RT-PCR、免疫组化和western blotting的结果显示脑源性神经营养因子阳性表达,同时,western blotting显示神经营养素-4/5阳性表达。RT-PCR、免疫组化和western blotting的结果均显示神经生长因子和神经营养素-3在细胞内呈阴性表达。第三部分:检测NTs对hDPSCs增殖与分化的影响。取第3～5代hDPSCs,用不同浓度的NTs刺激细胞生长,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测NTs对细胞增殖的影响;通过检测细胞碱性磷酸酶活性的变化观察NTs对hDPSCs分化的影响。结果:与对照组相比,25ng/mL NGF和25ng/mL BDNF可显著促进牙髓干细胞的增殖(P<0.05),但对细胞的分化无明显作用;同时,100ng/mL NGF和100ng/mL BDNF,对细胞的增殖无明显促进作用(P>0.05),但可显著提高细胞碱性磷酸酶活性(P<0.05)。NT-3和NT-4/5刺激牙髓干细胞增殖活性与对照组相比无统计学意义(P>0.05),但25ng/mL NT-3和25ng/mL NT-4/5可提高细胞碱性磷酸酶活性(P<0.05)。实验结果提示不同种类、不同浓度的NTs对细胞的作用不同。一定浓度的NGF和BDNF可对牙髓干细胞发挥明显的促增殖效应,一定浓度的NTs能显著提高牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性,提示NTs能促进牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化。