miR-106b靶向调控胰岛素产生细胞诱导过程中Ngn3基因的表达

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目的探讨小鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)向胰岛素产生细胞(insulin-secreting cells, ISCs)的诱导分化并鉴定诱导过程中miR-106b靶向调控神经元素3(neurogenin3,Ngn3)基因的表达。方法首先,分离培养BMMSCs,应用活化素A(activin A)和β细胞素(betacellulin)将其诱导为ISCs,采用双硫腙(DTZ)染色和免疫荧光检测胰岛素的表达。然后,运用生物信息学方法对miR-106b和Ngn3基因的配对关系进行预测并通过双荧光素酶报告系统验证。Real-time PCR检测诱导过程中miR-106b和Ngn3基因的表达。结果BMMSCs经传代纯化后,形态均一,分布均匀,比较规则,呈长梭形。诱导后的ISCs变为椭圆形或者圆形,排列紧密,成团悬起,诱导效率大约为30%;DTZ染色显示亮红色或猩红色,表明细胞中有锌离子参与胰岛素合成;免疫荧光化学发现诱导2w后的ISCs有胰岛素的表达,呈绿色荧光。靶基因预测软件miRanda和TargetScan分别显示miR-106b和Ngn3基因配对关系良好。双荧光素酶报告系统鉴定发现miR-106b可以作用于Ngn33’UTR进而有效抑制其表达。Real-time PCR结果显示随着诱导时间的延长,Ngn3的表达量逐渐升高而miR-106b的表达量逐渐降低,二者呈负相关(r=-0.458,P<0.01)。结论miR-106b能够负性调控ISCs诱导过程中Ngn3基因的表达。
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