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肉孢子虫是家畜常见的胞内寄生原虫,其导致的肉孢子虫病常致使宿主生长发育缓慢,严重时引起死亡。我国是牦牛出栏量最大的国家,其主要出产在青藏高原,是当地牧民主要的经济来源。目前,牦牛体内发现的肉孢子虫有2种,牦牛犬肉孢子虫(Sarcocystis poephagicanis Wei,1983)和牦牛肉孢子虫(S.poephagi Wei,1983),但原始描述简单,且没有提供任何分子数据。本实验利用形态学和4种分子标记(18S rDNA、28S rDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因)对采自西藏地区(拉萨市、那曲市和日喀则市)的牦牛肉孢子虫的自然感染情况、种类和分子系统学进行了研究。本次共采集了 101头牦牛的肌肉样品,镜检后发现肉孢子虫的自然感染率为63.37%(64/101)。基于形态学和4种分子标记特征,共鉴定出5种肉孢子虫:人肉孢子虫(S.hominis Raillietand Lucet,1891)、哈氏肉孢子虫(S.heydorni Dubey,2015)、毛形肉孢子虫(S.hirsuta Moule,1888)、牦牛犬肉孢子虫(S.poephagicanis)和牦牛未定种肉孢子虫(Sarcocystis sp.)。人肉孢子虫(S.hominis)包囊在光镜下有栅栏状突起,长3.9-11.2μm,平均7.1μm(n=38);电镜下包囊表面突起直立指状,突起内有微管。其18S rDNA、28S rDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因不同克隆之间的平均相似度分别为98.9%(n=9)、99.0%(n=9)、98.7%(n=9)、97.0%(n=9)。。18S rDNA序列与GenBank中黄牛源的人肉孢子虫(S.hominis)的18S rDNA序列相似度最高,平均相似度为98.5%;线粒体COX1基因序列与GenBank中人源的人肉孢子虫(S.hominis)的线粒体COX1基因序列相似度最高,平均相似度为98.3%。哈氏肉孢子虫(S.heydorni)包囊壁薄,高倍镜下有短锥状突起,长1.0-1.8μm,平均1.4μm(n=23);电镜下包囊表面有小方砖形突起,突起之间的空隙大于突起的宽度。其18SrDNA、28SrDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因不同克隆之间的平均相似度分别为99.2%(n=7)、98.4%(n=9)、99.2%(n=12)、95.8%(n=8)。18S rDNA和线粒体COX1基因序列与GenBank中黄牛源的哈氏肉孢子虫(S.heydorni)的18SrDNA和线粒体COX1基因序列相似度最高,平均相似度分别为99.3%和99.4%。毛形肉孢子虫(S.hirsuta)包囊在光镜下有倾斜指状突起,长3.0-5.00μm,平均4.1μm(n=44),突起内有一条与包囊表面平行的纵行黑线;电镜下包囊表面有倾斜指状突起,突起中部膨大,两端稍窄,突起表面呈锯齿状。其18SrDNA、28S rDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因不同克隆之间的平均相似度分别为99.0%(n=9)、98.6%(n=8)、99.7%(n=12)、96.2%(n=9)。18SrDNA、28S rDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因序列与GenBank中黄牛源的毛形肉孢子虫(S.hirsuta)的相应序列相似度最高,平均相似度分别为99.0%、99.0%、99.4%和94.8%。牦牛犬肉孢子虫(S.poephagicanis)包囊在光镜下突起毛发状,电镜下,包囊突起呈短棍棒状。其18SrDNA、28SrDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因不同克隆之间的平均相似度分别为99.3%(n=7)、98.7%(n=8)、98.7%(n=9)、96.8%(n=8)。18S rDNA和ITS1基因序列与GenBank中相似度最高的是黄牛的枯氏肉孢子虫(S.cruzi Hasselmann,1926)的相应序列,平均相似度分别为98.2%和73.9%。线粒体COX1基因和28S rDNA序列相似度最高的是S.rangi(Gjerde,1984)和S.levinei(Dissanaikeand Kan,1978)的相应序列,平均相似度分别为91.7%和97.2%。牦牛未定种肉孢子虫(Sarcocystis sp.)包囊在光镜下突起倾斜指状,长1.9-4.7μm,平均3.4μm(n=48);电镜下包囊表面有呈覆瓦状多层排列的突起,突起表面有电子致密层,基质层内有集结成束的微管。其18SrDNA、28SrDNA、线粒体COX1基因和ITS1基因不同克隆之间的平均相似度分别为98.7%(n=7)、98.3%(n=9)、99.6%(n=12)、95.8%(n=9)。18SrDNA、28SrDNA和线粒体COX1基因序列与GenBank中相似度最高的分别为水牛源的梭状肉孢子虫(S.fusiformis Railliet,1897)(平均相似度为92.4%)、水牛肉孢子虫(S.buffalonisHuong,Dubey,Nikkila and Uggla,1997)(平均相似度为90.5%)和黄牛的偌氏肉孢子虫(S.rommeli Dubey,2015)(平均相似度为81.3%)。基于分子标记序列构建的系统发育树表明牦牛的人肉孢子虫(S.hominis)与来自黄牛(中间宿主)或人(终末宿主)的人肉孢子虫(S.hominis)序列聚成独立的进化分支,与终末宿主是猫科动物的反刍动物的肉孢子虫聚为一支;牦牛的哈氏肉孢子虫(S.hevdorni)与黄牛的哈氏肉孢子虫(S.hevdorni)序列聚成独立的进化分支,与终末宿主是犬科动物的反刍动物的肉孢子虫聚为一支;牦牛的毛形肉孢子虫(S.hirsuta)与GenBank黄牛的毛形肉孢子虫(S.hirsuta)序列聚成独立的进化分支,与终末宿主是猫科动物的反刍动物的肉孢子虫聚为一支;牦牛犬肉孢子虫(S.poephagicanis)独立聚成单一进化分支,与终末宿主是犬科动物的反刍动物的肉孢子虫聚为一支;牦牛未定种肉孢子虫(Sarcocystis sp.)的序列独立聚成单一进化分支,与终末宿主为猫科动物的反刍动物的肉孢子虫聚为一支。总之,基于形态观察和4种分子标记的分析,可以推断出人肉孢子虫(S.hominis)、哈氏肉孢子虫(S.heydorni)和毛形肉孢子虫(S.hirsuta)应是牦牛与黄牛共同享有的肉孢子虫物种;而牦牛未定种肉孢子虫(Sarcocystis sp.)和牦牛犬肉孢子虫(S.poephagicanis)应只是牦牛的肉孢子虫物种。