研究一:Wip1基因缺失对小鼠心功能的影响目的:野生型 p53 诱导的磷酸酶 1(Wildtypep53-induced phosphatase1,Wip1)在很多疾病和生理过程中起着重要作用,但其在心脏中的作用尚未研究报道。本研究探讨敲除Wip1基因对小鼠心功能的影响及心脏组织中基因和蛋白表达水平的变化。方法:随机选取野生型(Wildtype,WT)小鼠和Wip1基因敲除(Wip1 knockout,Wip1-KO)小鼠各10只,分别检测两组小鼠的心功能和心脏重量/体重比,应用苏木精伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色观察小鼠心肌组织的病理形态,应用实时定量反转录聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测心肌组织中 Wip1、心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein,MCP-1)和 α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的基因表达水平,并应用蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测凋亡相关蛋白包括B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma,Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,c-caspase3)表达水平。结果:与WT小鼠相比,Wip1-KO小鼠心肌组织中Wip1 mRNA表达明显降低,左室射血分数和缩短分数降低,左心室收缩末期内径增大。虽然Wip1-KO小鼠的心脏重量与WT小鼠之间没有差异,但Wip1-KO小鼠体重较WT小鼠减轻,心重/体重比增加。HE染色结果显示Wip1-KO小鼠的心肌形态与WT小鼠之间没有明显差异。心肌组织中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表达水平在两组小鼠之间没有统计学差异。Wip1-KO小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和c-caspase3表达水平与WT小鼠之间没有明显差异。结论:敲除Wip1基因可以损害小鼠心功能,但相关的机制还有待进一步阐明。研究二:敲除Wip1基因加重心肌梗死引起的缺血性损伤目的:既往有很多关于Wip1在肿瘤和不同类型干细胞中调节作用的报道,但Wip1在心肌梗死中的作用尚未有研究。本研究拟探讨Wip1在心肌梗死中的作用以及可能的分子机制。方法:通过永久性结扎小鼠左前降支冠状动脉构建心肌梗死模型。心肌梗死模型构建成功后,持续观察小鼠4周,统计小鼠生存率。应用小鼠心脏超声检测系统评估小鼠心功能,通过测量小鼠心脏重量/体重比和麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin,WGA)染色检测小鼠心脏肥厚情况,心肌组织切片后行HE染色评估小鼠心肌梗死面积,行Masson染色检测小鼠心肌组织纤维增生情况。通过RT-PCR方法检测小鼠心肌组织中白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1 β(Interleukin-1 β,IL-1 β)和胶原纤维Collagen I的基因表达水平,通过Western blot检测小鼠心肌组织中信号转导及转录激活蛋白 3(Signal transducers and activators of transcription 3,stat3)、磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(Phosphor-stat3,p-stat3)以及雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin,mTOR)底物激酶pS6的表达水平。结果:与WT小鼠相比,心肌梗死后Wip1-KO小鼠死亡率较高,心肌肥厚程度较重,心功能降低较明显。HE染色结果显示Wip1-KO小鼠心肌梗死面积较大,Masson染色显示两组小鼠的心肌纤维增生在术后均有增加,但两组之间没有统计学差异,Collagen I的基因表达水平在两组小鼠之间也没有差异。RT-PCR结果表明Wip1-KO小鼠中IL-6 mRNA表达较低,而TNF-α mRNA和IL-1 β mRNA的表达在两组小鼠之间没有统计学差异。虽然心肌梗死后两组小鼠的stat3磷酸化均有增加,但Wip1-KO小鼠中p-stat3表达较低,两组小鼠之间具有统计学差异。两组小鼠之间pS6表达水平没有统计学差异。结论:敲除Wip1基因可以加重心肌梗死引起的缺血损伤。研究三:α B-crystallin和HspB2在Tsc1基因敲除引起的心肌损伤中的作用目的:既往研究报道αB晶体蛋白(αB-crystallin)在雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin,mTOR)活化诱导的细胞和动物模型中起着促进肿瘤发生发展的作用。具有分子伴侣功能的αB-crystallin和HspB2都是小分子热休克蛋白,可以辅助维持心脏稳态。本实验室前期研究发现敲除Tsc1基因可以引起心脏增大等心肌损伤,而Tsc1基因敲除小鼠中αB-crystallin和HspB2表达上调。但α B-crystallin和HspB2在mTOR活化诱导的心肌损伤中有着怎样的作用并不清楚。方法:本课题共构建心脏特异性敲除Tsc1基因小鼠(Tsc1 heart conditional-KO,T1-hKO)、αB-crystallin 和 HspB2 双基因敲除小鼠(Double knockout,dKO)、Tsc1,α B-crystallin和HspB2三基因敲除小鼠(Triple knockout,tKO)和对照小鼠(Control,CTLs)四种基因敲除小鼠。观察四种基因型小鼠的生存率,应用超声评估小鼠的心功能,称量小鼠体重和心脏重量,计算小鼠心脏重量/体重比,通过组织病理染色分析小鼠病理形态改变,应用RT-PCR方法评估小鼠心肌组织中胚胎基因心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)、α-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin,α-SKA)和β-肌球重链蛋白(β-myosin heavy chain,β-MHC)的表达水平,应用HE染色评估小鼠心肌形态、WGA染色检测小鼠心肌细胞面积、Masson染色观察小鼠心脏纤维化程度,应用电镜观察小鼠心肌超微结构改变以及通过Western blot检测小鼠心肌组织中蛋白表达水平。结果:敲除αB-crystallin和HspB2基因可以减少T1-hKO小鼠的死亡率。超声结果显示,T1-hKO小鼠心功能明显下降,但敲除αB-crystallin和HspB2基因可以改善T1-hKO小鼠心功能。T1-hKO组小鼠心重/体重比增加,心肌细胞面积增大,tKO组小鼠的心肌细胞面积较T1-hKO组小鼠减小。组织学染色分析发现T1-hKO组小鼠出现心肌细胞损伤,心脏纤维化增加,而tKO组小鼠心肌细胞损伤减轻,心脏纤维化明显缓解。心肌组织细胞超微结构结果显示T1-hKO组小鼠心肌细胞中线粒体结构明显异常,体积肿大,线粒体嵴数量减少、肌纤维变性、肌节连接异常,而tKO组小鼠中线粒体、肌纤维等结构基本恢复到正常状态。T1-hKO组小鼠心肌组织中抗增殖细胞核抗原抗体(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)染色阳性部分强度明显增加,说明细胞处于旺盛的增殖状态,而tKO组小鼠中PCNA染色较其减弱,增殖程度减轻。进一步探究可能的分子机制发现,敲除αB-crystallin和HspB2基因可以抑制mTOR信号通路,即α B-crystallin和HspB2基因可能通过mTOR信号通路调节心肌损伤。结论:α B-crystallin和HspB2在mTOR活化诱导的心肌损伤中发挥着重要作用,α B-crystal 1 in和HspB2可能通过mTOR信号通路调节小鼠心功能和心肌细胞存活。